| 中文摘要 | 第1-18页 |
| 英文摘要 | 第18-29页 |
| 主要缩略词表 | 第29-30页 |
| 1 文献综述 | 第30-62页 |
| 1．1 家蚕性别控制及单养雄蚕的研究进展 | 第30-35页 |
| 1．1．1 蚕的自发单性生殖 | 第30页 |
| 1．1．2 蚕的诱发单性生殖 | 第30-31页 |
| 1．1．2．1 雄性化的单性生殖 | 第31页 |
| 1．1．2．2 雄核发育 | 第31页 |
| 1．1．3 利用形态标记鉴别雌雄 | 第31-33页 |
| 1．1．3．1 限性斑纹系统 | 第32页 |
| 1．1．3．2 限性蚁色系统 | 第32页 |
| 1．1．3．3 限性卵色系统 | 第32-33页 |
| 1．1．4 基因作用控制性别 | 第33-34页 |
| 1．1．4．1 伴性平衡致死系统 | 第33-34页 |
| 1．1．4．2 非性连锁平衡致死系 | 第34页 |
| 1．1．5 环境与基因互作控制性别 | 第34-35页 |
| 1．2 基因表达的比较研究技术和全长cDNA基因的克隆策略 | 第35-62页 |
| 1．2．1 在转录水平研究基因表达差异的经典方法 | 第36-37页 |
| 1．2．1．1 Northern印跡法 | 第36页 |
| 1．2．1．2 RNase保护试验 | 第36页 |
| 1．2．1．3 减法cDNA文库技术 | 第36-37页 |
| 1．2．2 在转录水平研究基因表达差异的现代方法 | 第37-62页 |
| 1．2．2．1 差别显示（Differential Display） | 第37-44页 |
| 1．2．2．1．1 基因差别显示的基本原理和步骤 | 第37-38页 |
| 1．2．2．1．2 差别显示的优点 | 第38-39页 |
| 1．2．2．1．3 差别显示的不足之处 | 第39-40页 |
| 1．2．2．1．4 差别显示方法和技术上的改良 | 第40-42页 |
| 1．2．2．1．4．1 DD-PCR方法本身的改进 | 第40页 |
| 1．2．2．1．4．2 DD-PCR技术的改进 | 第40-42页 |
| 1．2．2．1．4．2．1 代表性差异分析（RDA） | 第40-41页 |
| 1．2．2．1．4．2．2 RC4D法 | 第41-42页 |
| 1．2．2．1．4．2．3 cDNA-AFLP法 | 第42页 |
| 1．2．2．2 表达序列标签（ESTs） | 第42页 |
| 1．2．2．3 基因表达的连续分析（SAGE） | 第42-44页 |
| 1．2．2．4 DNA微阵列法（DNA microarray） | 第44页 |
| 1．2．3 在翻译水平研究基因表达差异的技术方法 | 第44-48页 |
| 1．2．3．1 蛋白质的2D-PAGE分离 | 第45-46页 |
| 1．2．3．2 蛋白质的鉴定 | 第46页 |
| 1．2．3．3 表达蛋白质的作图 | 第46-47页 |
| 1．2．3．4 蛋白质复合物的鉴定 | 第47-48页 |
| 1．2．4 克隆全长cDNA基因 | 第48-62页 |
| 1．2．4．1 利用PCR技术筛选cDNA文库获取全长cDNA基因（RC—PCR） | 第48-49页 |
| 1．2．4．2 快速简便的cDNA末端快速扩增法（RACE） | 第49-61页 |
| 1．2．4．2．1 RACE技术的基本原理及步骤 | 第50-52页 |
| 1．2．4．2．2 RACE技术的优化和改良 | 第52-61页 |
| 1．2．4．2．2．1 反转录 | 第52-53页 |
| 1．2．4．2．2．2 TdT加尾和第二链合成 | 第53-54页 |
| 1．2．4．2．2．3 加尾的其它替代方法 | 第54-56页 |
| 1．2．4．2．2．4 PCR扩增 | 第56-61页 |
| 1．2．4．2．2．4．1 PCR的忠实性问题 | 第56-57页 |
| 1．2．4．2．2．4．2 引物的设计 | 第57页 |
| 1．2．4．2．2．4．3 PCR参数 | 第57-58页 |
| 1．2．4．2．2．4．4 增加特异性 | 第58-59页 |
| 1．2．4．2．2．4．5 RACE产物的克隆 | 第59-61页 |
| 1．2．4．3 mRNA 5’-端逐渐步移技术 | 第61页 |
| 1．2．4．4 用锚定PCR从基因文库中快速扩增基因末端（RAGE） | 第61-62页 |
| 1．2．4．5 利用RACE技术及EST重叠片断拼接法寻找全长基因。 | 第62页 |
| 2 引言 | 第62-65页 |
| 2．1 研究背景及研究意义 | 第63-64页 |
| 2．2 技术路线 | 第64-65页 |
| 3 材料与方法 | 第65-76页 |
| 3．1 供试材料 | 第65页 |
| 3．1．1 材料来源和特性 | 第65页 |
| 3．1．2 蚕种的催青处理及取样 | 第65页 |
| 3．2 总RNA的制备 | 第65-67页 |
| 3．2．1 RNA提取前的准备工作 | 第65-66页 |
| 3．2．2 总RNA的提取 | 第66页 |
| 3．2．3 提取总RNA的纯度鉴定及含量测定 | 第66页 |
| 3．2．4 总RNA样品中DNA的去除 | 第66-67页 |
| 3．3 基因的差别显示 | 第67-69页 |
| 3．3．1 差别显示的引物 | 第67页 |
| 3．3．2 反转录反应，（第一链cDNA的合成） | 第67-68页 |
| 3．3．3 PCR扩增（双链cDNA的合成） | 第68页 |
| 3．3．4 测序胶（6％变性PAG）电泳 | 第68页 |
| 3．3．5 采用非放射性的银染法 | 第68-69页 |
| 3．4 cDNA目的片段的回收及探针的再扩增 | 第69页 |
| 3．4．1 cDNA目的片段的回收 | 第69页 |
| 3．4．2 探针的再扩增 | 第69页 |
| 3．5 Northern Blot检测 | 第69-71页 |
| 3．5．1 标记DNA探针 | 第69页 |
| 3．5．2 标记效率检测 | 第69-70页 |
| 3．5．3 变性琼脂糖凝胶电泳 | 第70页 |
| 3．5．4 转印及构筑转印平台 | 第70页 |
| 3．5．5 Northern杂交 | 第70-71页 |
| 3．5．6 洗膜（在杂交炉中进行） | 第71页 |
| 3．5．7 显色 | 第71页 |
| 3．6 差异片段的克隆 | 第71-74页 |
| 3．6．1 质粒载体的制备 | 第71-72页 |
| 3．6．2 目的片段的准备： | 第72页 |
| 3．6．3 目的片段与载体的连接 | 第72页 |
| 3．6．4 感受态细胞的制备 | 第72页 |
| 3．6．5 转化 | 第72-73页 |
| 3．6．6 阳性克隆的筛选及验证 | 第73-74页 |
| 3．7 测序 | 第74页 |
| 3．8 特异差示片段的5’-RACE延伸 | 第74-76页 |
| 3．8．1 5’-RACE基因特异引物（GSP）的设计 | 第74页 |
| 3．8．2 用于5’-RACE的总RNA的分离 | 第74页 |
| 3．8．3 第一链cDNA的合成 | 第74-75页 |
| 3．8．4 用GlassMAX DNA Isolation Spin Cartridge纯化第一链cDNA | 第75页 |
| 3．8．5 纯化cDNA的TdT加尾 | 第75页 |
| 3．8．6 加尾的cDNA的PCR | 第75-76页 |
| 3．8．7 嵌套式PCR扩增（Nested Amplification） | 第76页 |
| 3．8．8 5’-RACE产物的克隆：同差示片段的克隆。采用的是自制T载体的T-A克隆法 | 第76页 |
| 4 结果与分析 | 第76-101页 |
| 4．1 总RNA的提取 | 第76-77页 |
| 4．2 不同催青处理蚕卵的mRNA差别显示 | 第77-79页 |
| 4．3 特异cDNA片段的再扩增 | 第79页 |
| 4．4 差示片段的克隆 | 第79-80页 |
| 4．5 差示特异cDNA片段的序列 | 第80-81页 |
| 4．5．1 高温干燥催青24h的特异差示片段的序列 | 第80-81页 |
| 4．5．2 高温干燥催青36h的特异差示片段的序列 | 第81页 |
| 4．6 差异片段的Northern杂交鉴定 | 第81页 |
| 4．7 5’-RACE的第一、二轮PCR扩增产物 | 第81-83页 |
| 4．8 特异5’-RACE产物的回收和再扩增产物 | 第83页 |
| 4．9 5’-RACE延伸产物R600和R1000的克隆和重组质粒滞后鉴定 | 第83-84页 |
| 4．10 5’-RACE延伸产物R500和R1000的重组质粒的酶切鉴定 | 第84-85页 |
| 4．11 5’-RACE延伸片段的序列及其与差示序列的拼接 | 第85-87页 |
| 4．11．1 5’-RACE产物R_（561）的原始序列 | 第85页 |
| 4．11．2 5’-RACE产物R1030的原始序列 | 第85-86页 |
| 4．11．3 5’-RACE产物R561和R1030与差示片段8G273的拼接 | 第86-87页 |
| 4．12 拼接序列S749和S1214的序列分析 | 第87-101页 |
| 4．12．1 核酸同源性分析 | 第87-89页 |
| 4．12．1．1 S749的核酸同源性分析 | 第87页 |
| 4．12．1．2 S1214的核酸同源性分析 | 第87-89页 |
| 4．12．2 拼接序列S749和S1214的可能的ORFs | 第89-92页 |
| 4．12．2．1 拼接序列S749的可能的ORFs | 第89-90页 |
| 4．12．2．2 拼接序列S1214的可能的ORFs | 第90-92页 |
| 4．12．3 推定蛋白质ORF的同源性分析 | 第92-94页 |
| 4．12．3．1 S749的推定蛋白质ORF的同源性分析 | 第92-93页 |
| 4．12．3．2 S1214的推定蛋白质ORF的同源性分析 | 第93-94页 |
| 4．12．4 S1214的ORF与家蚕gag-like protein的分析 | 第94-95页 |
| 4．12．5 S749和S1214的编码区分析 | 第95-96页 |
| 4．12．5．1 S749的编码区分析 | 第95页 |
| 4．12．5．2 S1214的编码区分析 | 第95-96页 |
| 4．12．6 序列S1214与gag基因的同源性 | 第96-97页 |
| 4．12．7 S1214序列与家蚕gag-like protein的比较总结 | 第97-98页 |
| 4．12．8 S1214序列编码的蛋白质的二级结构预测 | 第98-100页 |
| 4．12．9 推定ORF的氨基酸组成 | 第100-101页 |
| 5 讨论 | 第101-110页 |
| 5．1 差别显示技术的关键问题 | 第101-105页 |
| 5．1．1 差显技术对生物材料的要求 | 第102-103页 |
| 5．1．2 RMA的完整性问题 | 第103-104页 |
| 5．1．3 差显使用的引物 | 第104页 |
| 5．1．4 非放射性银染差显 | 第104-105页 |
| 5．1．5 差显中假阳性的克服 | 第105页 |
| 5．2 差示片段的延伸 | 第105-107页 |
| 5．2．1 尽可能选择较大的差示特异片段用于RACE延伸 | 第106页 |
| 5．2．2 正确设计基因特异性引物 | 第106-107页 |
| 5．2．3． 提高RACE的特异性问题 | 第107页 |
| 5．3 关于sch蚕胚胎期的温敏性问题 | 第107-109页 |
| 5．4 继续研究的方向思考 | 第109-110页 |
| 5．4．1． 进一步寻找差异表达的基因或片段 | 第109页 |
| 5．4．2． 需进一步延长本研究中发现的两个RACE片段 | 第109-110页 |
| 5．4．3． 用荧光原位杂交（FISH）对S749和S1214进行染色体定位 | 第110页 |
| 5．4．4 进一步寻找S1214和S749的基因组部分 | 第110页 |
| 6 结论 | 第110-113页 |
| 6．1 采用RNA一步法提取的总RNA经DNase处理后完全适用于DDRT-PCR | 第110页 |
| 6．2 建立了一种适用于蚕卵mRNA差异显示的方法 | 第110页 |
| 6．3 得到了sch蚕高温催青下表达的4条差示片段 | 第110页 |
| 6．4 用5’-RACE延伸后得到了sch蚕在高温催青条件下特异表达的2个片段S749和S1214 | 第110页 |
| 6．5 拼接序列S749与GenBank中核酸和蛋白质具有较广泛的同源性。目前尚不能准确确定是什么基因 | 第110页 |
| 6．6 拼接序列S1214是反向插入到推定的肌醇磷脂-4-磷酸-5-磷酸激酶基因中的一个non-LTR类反转座子 | 第110-111页 |
| 6．7 根据本研究结果，结合查阅生物化学和信号传导途径，提出了一个解释sch系统高温致死性的假说 | 第111-113页 |
| 参考文献 | 第113-122页 |
| 在职博士学习期间发表的论文及著作一览表 | 第122-130页 |
| 致谢 | 第130页 |
