| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第8-9页 |
| 前言 | 第9-14页 |
| 第一部分 通用型四环素调控腺相关病毒载体的构建 | 第14-35页 |
| 材料和方法 | 第14-23页 |
| 一． 材料 | 第14-17页 |
| （一） 仪器与设备 | 第14页 |
| （二） 试剂与药品 | 第14-17页 |
| 1． 化学试剂 | 第14页 |
| 2． 质粒、菌种和工具酶 | 第14-15页 |
| 3． 引物 | 第15页 |
| 4． DNA分子量及蛋白标准 | 第15页 |
| 5． 主要溶液的配制 | 第15-17页 |
| 二． 方法 | 第17-23页 |
| （一） 常用方法及步骤 | 第17-20页 |
| 1． 感受态细菌的制备 | 第17页 |
| 2． 质粒DNA的酶切 | 第17页 |
| 3． DNA片段平端处理 | 第17页 |
| 4． DNA片段的回收 | 第17-18页 |
| 5． 粘性末端的连接 | 第18页 |
| 6． 质粒DNA的转化 | 第18页 |
| 7． 质粒DNA的小量提取 | 第18-19页 |
| 8． 质粒DNA的大量提取 | 第19页 |
| 9． 聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化质粒 | 第19-20页 |
| 10． 紫外分光光度法测定DNA的含量 | 第20页 |
| 11． PCR扩增 | 第20页 |
| （二） 四环素调控AAV载体质粒的构建 | 第20-23页 |
| 1． 通用型四环素调控AAV载体质粒pSVtTA的构建 | 第20-21页 |
| 2． 携带GFP基因的AAV载体质粒pSVtTA-GFP的构建 | 第21页 |
| 3． 通用型四环素正反馈调控AAV载体质粒pSVbitTA的构建 | 第21-22页 |
| 4． 携带EGFP基因的AAV载体质粒pSVbitTAEGFP的构建 | 第22页 |
| 5． 携带TH基因的AAV载体质粒pSVbitTATH的构建 | 第22-23页 |
| 实验结果 | 第23-31页 |
| 一． 通用型四环素调控腺伴随病毒载体pSVtTA | 第23页 |
| 二． 四环素调控腺伴随病毒载体pSVtTA-GFP | 第23页 |
| 三． 通用型四环素正反馈调控腺伴随病毒载体pSVbitTA | 第23页 |
| 四． 四环素调控腺伴随病毒载体pSVbitTA-EGFP | 第23页 |
| 五． 四环素调控腺伴随病毒载体pSVbitTA-TH | 第23页 |
| 六． 四环素调控腺伴随病毒载体pSVtTA、pSVtTA-GFP的鉴定 | 第23页 |
| 七． 四环素调控腺相关病毒载体pSVbitTA、pSVbitTA-EGFP、pSVbitTA-TH鉴定 | 第23-24页 |
| 八． PCR法对pSVbitTA-TH的鉴定 | 第24-31页 |
| 分析与讨论 | 第31-34页 |
| 结 论 | 第34-35页 |
| 第二部分 四环素调控AAV载体携带TH基因 | 第35-63页 |
| 材料与方法 | 第35-44页 |
| 一． 材料 | 第35-38页 |
| （一） 仪器与设备 | 第35页 |
| （二） 试剂与药品 | 第35-38页 |
| 1． 细胞培养用药品 | 第35页 |
| 2． 组织细胞酶化学用药品 | 第35页 |
| 3． 细胞株 | 第35-36页 |
| 4． 主要溶液的配制 | 第36-38页 |
| 二． 方法 | 第38-44页 |
| （一） 建立包装细胞系的实验方法 | 第38页 |
| 1． 细胞的复苏 | 第38页 |
| 2． 细胞的换液与传代 | 第38页 |
| 3． 细胞的冻存 | 第38页 |
| （二） 携带外源基因的四环素调控AAV载体细胞株的建立 | 第38-39页 |
| （三） rAAV-GFP的大规模制备 | 第39页 |
| （四） rAAV-GFP的纯化 | 第39页 |
| （五） rAAV-EGFP、rAAV-TH的大规模制备 | 第39-40页 |
| （六） 病毒的回收与纯化 | 第40页 |
| （七） 物理滴度的测定 | 第40页 |
| （八） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测rAAV的纯度 | 第40-41页 |
| （九） 纯化的rAAV-GFP中辅助病毒HSV-1的检测 | 第41页 |
| （十） 纯化的rAAV-EGFP、rAAV-TH中辅助病毒Ad的检测 | 第41页 |
| （十一） 载体功能鉴定的实验方法 | 第41-44页 |
| 1． pSVtTA-GFP、pSVbitTA-EGFP转染BHK-21细胞及强力霉素调控作用实验分组 | 第41-42页 |
| 2． rAAV-GFP、rAAV-EGFP感染BHK-21细胞及强力霉素调控作用实验分组 | 第42页 |
| 3． pSVbitTA携带TH基因转染BHK-21细胞及实验分组 | 第42-43页 |
| 4． TH免疫酶细胞化学 | 第43页 |
| 5． GDN呈色反应 | 第43-44页 |
| 实验实验 | 第44-53页 |
| 一． pSVTTA-GFP、pSVBITTA-EGFP在BHK-21细胞系中的表达 | 第44页 |
| 二． 强力霉素对AAV载体质粒介导GFP、EGFP在BHK-21细胞系表达的调控 | 第44页 |
| 三． 重组AAV的纯度检测 | 第44-45页 |
| 四． RAAV的辅助病毒检测 | 第45页 |
| 五． 包装出的重组AAV具有感染性 | 第45-46页 |
| 六． 强力霉素对重组AAV介导基因表达的调控作用 | 第46页 |
| 七． PSVBITTA携带TH基因在BHK-21细胞系的表达及强力霉素对表达的调控 | 第46-53页 |
| 分析与讨论 | 第53-56页 |
| 一． 基因治疗的重组病毒载体选择、制备和纯化 | 第53-54页 |
| 二． 强力霉素对质粒和病毒介导的外源基因表达进行调控 | 第54-55页 |
| 三． 重组AAV载体携带治疗基因为PD的治疗带来希望 | 第55-56页 |
| 结 论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 四环素药物诱导基因表达调控系统 | 第63-78页 |
| 一． 四环素诱导调控基因表达系统组成与作用原理 | 第63-65页 |
| 二． TRES的改进与发展 | 第65-67页 |
| 三． 靶向性 | 第67-68页 |
| 四． TRES与病毒载体 | 第68-69页 |
| 五． TRES的应用 | 第69-71页 |
| 1． in vitro | 第69页 |
| 2． in vivo | 第69-70页 |
| 3． 治疗 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-78页 |
| 帕金森病基因治疗的研究进展 | 第78-93页 |
| 一． PD基因治疗的主要策略——靶基因的选择 | 第78-81页 |
| （一） 改善中脑DA水平 | 第78-80页 |
| （二） 神经保护作用 | 第80-81页 |
| 二． PD基因的工具——载体的选择 | 第81-86页 |
| （一） 细胞载体 | 第81页 |
| （二） 病毒载体 | 第81-85页 |
| 1． 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus 1，HSV-1）载体 | 第82页 |
| 2． 腺病毒相关病毒载体 | 第82-84页 |
| 3． 慢病毒载体载体 | 第84-85页 |
| 4． 其它病毒载体 | 第85页 |
| （三） DNA直接注射 | 第85-86页 |
| 三． 展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-93页 |
| 致 谢 | 第93-94页 |
