| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 表格索引 | 第12-13页 |
| 图形索引 | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-29页 |
| 1 葡萄糖氧化酶研究进展 | 第15-21页 |
| ·葡萄糖氧化酶简介 | 第15-16页 |
| ·葡萄糖氧化酶的生产菌种 | 第16页 |
| ·葡萄糖氧化酶活力的测定 | 第16-17页 |
| ·葡萄糖氧化酶的应用 | 第17-20页 |
| ·食品和饮料生产 | 第17-18页 |
| ·酿酒类生产 | 第18页 |
| ·葡萄糖酸的生产 | 第18-19页 |
| ·口腔清洁 | 第19页 |
| ·纺织品制造 | 第19页 |
| ·生物传感器 | 第19页 |
| ·生物燃料电池 | 第19-20页 |
| ·葡萄糖氧化酶的分子生物学研究进展 | 第20-21页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第21-26页 |
| ·毕赤酵母表达宿主菌 | 第22-23页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第23-24页 |
| ·影响外源蛋白表达的主要因素 | 第24-26页 |
| ·外源基因的特性 | 第25页 |
| ·启动子的选择 | 第25页 |
| ·信号肽的选择 | 第25-26页 |
| ·蛋白酶的降解 | 第26页 |
| ·发酵条件的影响 | 第26页 |
| 3 本研究的目的意义和内容 | 第26-29页 |
| 第二章 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第29-67页 |
| 1 材料与方法 | 第29-43页 |
| ·材料 | 第29-32页 |
| ·菌株与质粒 | 第29页 |
| ·主要工具酶与试剂 | 第29页 |
| ·主要仪器和设备 | 第29-30页 |
| ·培养基和主要试剂的配制 | 第30-32页 |
| ·培养基 | 第30-31页 |
| ·培养基贮存液 | 第31页 |
| ·黑曲霉和酵母基因组DNA提取的相关试剂 | 第31页 |
| ·碱裂解法提取质粒的相关试剂 | 第31-32页 |
| ·电击转化毕赤酵母的相关试剂 | 第32页 |
| ·葡萄糖氧化酶活性测定的相关溶液 | 第32页 |
| ·方法 | 第32-43页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析 | 第32-35页 |
| ·Aspergillus niger Z-25基因组DNA的提取 | 第32-33页 |
| ·引物设计与PCR扩增 | 第33页 |
| ·PCR产物的纯化及其与pMD19-T载体的连接 | 第33页 |
| ·大肠杆菌感受态制备和连接产物的转化 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆的筛选与重组质粒的提取 | 第34-35页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的序列分析 | 第35页 |
| ·分泌型表达载体pPICZαA-GOD的构建 | 第35-37页 |
| ·引物设计与PCR扩增 | 第35页 |
| ·PCR产物和表达载体pPICZαA的双酶切 | 第35-36页 |
| ·葡萄糖氧化酶基因与表达载体pPICZαA的连接以及连接产物的转化 | 第36页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第36-37页 |
| ·重组质粒pPICZαA-GOD的测序 | 第37页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-GOD电击转化毕赤酵母SMD1168 | 第37-38页 |
| ·重组质粒pPICZaA-GOD的大量提取与线性化 | 第37页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第37-38页 |
| ·重组质粒pPICZαA-GOD的电击转化 | 第38页 |
| ·多拷贝转化子的筛选与鉴定 | 第38-39页 |
| ·酵母转化子的zeocin抗性筛选 | 第38页 |
| ·酵母基因组DNA的提取 | 第38页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第39-40页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的诱导表达 | 第39页 |
| ·葡萄糖氧化酶的活力测定 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第39页 |
| ·蛋白含量测定 | 第39-40页 |
| ·重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的发酵条件研究 | 第40-41页 |
| ·摇瓶发酵产酶条件的研究 | 第40-41页 |
| ·发酵罐高密度培养条件的研究 | 第41页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的纯化以及酶学性质的研究 | 第41-43页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的粗酶液制备 | 第41页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的分离纯化 | 第41-42页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶最适反应温度和温度稳定性的测定 | 第42页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶最适作用pH和pH稳定性的测定 | 第42页 |
| ·金属离子对重组葡萄糖氧化酶活性的影响 | 第42页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶动力学参数的测定 | 第42-43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-61页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析 | 第43-46页 |
| ·Aspergillus niger Z-25基因组DNA的提取 | 第43页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆 | 第43-45页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的序列分析 | 第45-46页 |
| ·分泌型表达载体pPICZαA-GOD的构建 | 第46-49页 |
| ·葡萄糖氧化酶基因的PCR扩增 | 第46-47页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-GOD的构建与鉴定 | 第47-49页 |
| ·表达载体pPICZαA-GOD电击转化毕赤酵母和酵母转化子的筛选 | 第49-52页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-GOD的线性化 | 第49-50页 |
| ·酵母转化子的zeocin抗性筛选 | 第50-51页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第51-52页 |
| ·Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第52-55页 |
| ·重组毕赤酵母菌株表达葡萄糖氧化酶的活力曲线测定 | 第52-53页 |
| ·重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的摇瓶发酵条件研究 | 第53-55页 |
| ·发酵罐高密度培养条件的研究 | 第55页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的纯化以及酶学性质的研究 | 第55-61页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的分离纯化和分子量的测定 | 第55-58页 |
| ·温度对重组葡萄糖氧化酶活性和稳定性的影响 | 第58页 |
| ·pH对重组葡萄糖氧化酶活性和稳定性的影响 | 第58-59页 |
| ·金属离子对重组葡萄糖氧化酶活性的影响 | 第59-60页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的动力学参数测定 | 第60页 |
| ·重组酶与天然酶的性质比较 | 第60-61页 |
| 3 讨论 | 第61-66页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备和电击转化 | 第61-62页 |
| ·多拷贝转化子的筛选与鉴定 | 第62页 |
| ·信号肽的选择 | 第62-63页 |
| ·重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的发酵条件 | 第63-64页 |
| ·重组葡萄糖氧化酶的分离纯化 | 第64页 |
| ·不同来源的葡萄糖氧化酶的性质比较 | 第64-65页 |
| ·进一步提高重组葡萄糖氧化酶活力的方法 | 第65-66页 |
| 4 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 研究生期间发表的研究论文 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
