| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩写符号 | 第12-13页 |
| 表格索引 | 第13-15页 |
| 图形索引 | 第15-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-36页 |
| 1 微生物脂肪酶研究进展 | 第18-25页 |
| ·脂肪酶来源和分类 | 第19-21页 |
| ·耐有机溶剂的脂肪酶 | 第21-22页 |
| ·耐有机溶剂脂肪酶的来源 | 第21页 |
| ·耐有机溶剂脂肪酶的特性 | 第21-22页 |
| ·耐有机溶剂脂肪酶的优点 | 第22页 |
| ·微生物脂肪酶的应用 | 第22-25页 |
| ·脂肪酶在食品加工中的应用 | 第22-23页 |
| ·利用脂肪酶拆分手性化合物 | 第23-24页 |
| ·环境污染治理 | 第24页 |
| ·脂肪酶在造纸行业中的应用 | 第24页 |
| ·脂肪酶在药物和化妆品中的应用 | 第24页 |
| ·脂肪酶在生物能源中的应用 | 第24-25页 |
| 2 脂肪酶的分子生物学研究 | 第25-30页 |
| ·脂肪酶的分子结构 | 第25-27页 |
| ·脂肪酶的一级结构 | 第25页 |
| ·脂肪酶的二级结构 | 第25-26页 |
| ·脂肪酶的三级结构 | 第26-27页 |
| ·微生物脂肪酶的基因克隆与表达 | 第27-28页 |
| ·微生物脂肪酶的分子改造 | 第28-30页 |
| ·理性设计(Rational Design) | 第28-29页 |
| ·定向进化(Directed Evolution) | 第29-30页 |
| 3 大肠杆菌表达系统的概述 | 第30-33页 |
| ·大肠杆菌表达系统的优点 | 第30页 |
| ·大肠杆菌表达系统的缺点 | 第30-31页 |
| ·各种类型大肠杆菌表达系统的构成及特点 | 第31-32页 |
| ·Lac和Tac表达系统 | 第31页 |
| ·PL和PR表达系统 | 第31页 |
| ·T7表达系统 | 第31-32页 |
| ·大肠杆菌表达系统研究进展 | 第32-33页 |
| 4 枯草芽孢杆菌表达系统的概述 | 第33-35页 |
| ·枯草芽孢杆菌的优越性 | 第33页 |
| ·外源蛋白的分泌表达 | 第33-34页 |
| ·信号肽和信号肽酶 | 第34-35页 |
| 5 本研究的目的意义及内容 | 第35-36页 |
| ·研究目的意义 | 第35页 |
| ·研究内容 | 第35-36页 |
| 第二章 Staphylococcus saprophyticus M36 | 第36-49页 |
| 1 材料与方法 | 第36-41页 |
| ·材料 | 第36-38页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·化学试剂 | 第36-37页 |
| ·质粒与菌株 | 第37页 |
| ·溶液配制 | 第37页 |
| ·PCR引物 | 第37-38页 |
| ·培养基 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-41页 |
| ·腐生葡萄球菌总DNA提取 | 第38页 |
| ·紫外光谱分析法测定DNA纯度 | 第38页 |
| ·全长目的基因lip3的PCR扩增及产物纯化 | 第38-39页 |
| ·SiteFinding-PCR扩增目的基因lip5 | 第39-40页 |
| ·PCR产物与载体pMD19-T的连接 | 第40页 |
| ·大肠杆菌感受态制备 | 第40-41页 |
| ·载体pMD19-T连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第41页 |
| ·PCR产物的克隆、鉴定 | 第41页 |
| 2 结果与分析 | 第41-47页 |
| ·腐生葡萄球菌总DNA提取 | 第41页 |
| ·脂肪酶基因lip3的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定 | 第41-42页 |
| ·脂肪酶基因lip5的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定 | 第42-45页 |
| ·脂肪酶基因lip5内部片段的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定 | 第42-43页 |
| ·Site-finding PCR方法扩增脂肪酶基因lip5上下游序列 | 第43-44页 |
| ·脂肪酶基因lip5全长基因的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定 | 第44-45页 |
| ·腐生葡萄球菌脂肪酶基因序列分析 | 第45-46页 |
| ·腐生葡萄球菌脂肪酶三维模型预测 | 第46-47页 |
| 3 讨论 | 第47页 |
| 4 小结 | 第47-49页 |
| 第三章 脂肪酶lip3基因在大肠杆菌中的表达及性质研究 | 第49-69页 |
| 1 材料与方法 | 第50-58页 |
| ·材料 | 第50-52页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第50页 |
| ·质粒与菌株 | 第50页 |
| ·PCR引物 | 第50-51页 |
| ·培养基 | 第51页 |
| ·试剂的配制 | 第51-52页 |
| ·方法 | 第52-58页 |
| ·重组工程菌的构建 | 第52-53页 |
| ·目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第53-55页 |
| ·BL21/pET-DsbA-lip3表达条件的优化 | 第55-56页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第56页 |
| ·表达产物Ni-NTA亲和层析纯化及融合蛋白配体的酶切 | 第56-57页 |
| ·重组酶的酶学性质的测定 | 第57-58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-68页 |
| ·pET-DsbA-lip3重组质粒的构建 | 第58-59页 |
| ·目的基因PCR扩增 | 第58页 |
| ·pET-DsbA载体和目的基因的制备 | 第58页 |
| ·pET-DsbA载体和目的基因的连接及鉴定 | 第58-59页 |
| ·l lip3在大肠杆菌中的诱导表达 | 第59-68页 |
| ·重组质粒稳定性检测 | 第59页 |
| ·罗丹明B固体琼脂平板鉴定BL21/pET-DsbA-lip3表达产物 | 第59-60页 |
| ·重组菌体表达产物的SDS-PAGE分析及活性染色分析 | 第60-61页 |
| ·BL21/pET-DsbA-lip3表达条件的优化 | 第61-63页 |
| ·表达产物Ni-NTA亲和层析纯化及融合蛋白配体的酶切 | 第63-64页 |
| ·活力的测定 | 第64-65页 |
| ·重组酶酶学性质的测定 | 第65-68页 |
| 3 讨论 | 第68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 脂肪酶基因lip3在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第69-80页 |
| 1 材料与方法 | 第69-73页 |
| ·材料 | 第69-70页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第69页 |
| ·质粒与菌株 | 第69-70页 |
| ·PCR引物 | 第70页 |
| ·培养基及试剂的配制 | 第70页 |
| ·方法 | 第70-73页 |
| ·枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建 | 第70-72页 |
| ·枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 | 第72页 |
| ·枯草芽孢杆菌的电转化 | 第72页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第72-73页 |
| ·重组质粒在枯草芽孢杆菌中的诱导表达 | 第73页 |
| ·重组脂肪酶活性的检测及SDS-PAGE分析 | 第73页 |
| ·重组脂肪酶的酶学性质 | 第73页 |
| 2 结果与分析 | 第73-79页 |
| ·枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建 | 第73-74页 |
| ·pHT43-lip3的电击转化及阳性转化子的鉴定 | 第74页 |
| ·重组质粒在枯草芽孢杆菌中的诱导表达及产物检测、SDS-PAGE分析 | 第74-75页 |
| ·重组脂肪酶的酶学性质 | 第75-78页 |
| ·重组脂肪酶的有机溶剂耐性 | 第75-76页 |
| ·重组脂肪酶的最适温度及温度稳定性 | 第76-77页 |
| ·重组脂肪酶的最适pH及pH稳定性 | 第77页 |
| ·金属离子对重组脂肪酶酶活的影响 | 第77-78页 |
| ·重组脂肪酶pHT43-lip3与pET-lip3酶学性质的比较 | 第78-79页 |
| 3 讨论 | 第79页 |
| 4 小结 | 第79-80页 |
| 第五章 脂肪酶基因lip5的定点突变 | 第80-88页 |
| 1 材料和方法 | 第80-83页 |
| ·材料 | 第80-81页 |
| ·主要仪器 | 第80页 |
| ·菌株与载体 | 第80页 |
| ·PCR引物 | 第80-81页 |
| ·培养基及试剂的配制 | 第81页 |
| ·方法 | 第81-83页 |
| ·lip5的定点突变 | 第81-82页 |
| ·枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建 | 第82页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第82页 |
| ·重组质粒在枯草芽孢杆菌中的诱导表达 | 第82页 |
| ·重组脂肪酶的SDS-PAGE分析 | 第82页 |
| ·重组脂肪酶的酶学性质 | 第82-83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-87页 |
| ·lip5的定点突变 | 第83-84页 |
| ·突变基因的获得:第一、二轮PCR | 第83页 |
| ·突变基因的获得:第三轮PCR | 第83-84页 |
| ·枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建及阳性重组子的鉴定 | 第84页 |
| ·重组质粒在枯草芽孢杆菌中的转化、表达及重组脂肪酶活性的检测 | 第84-85页 |
| ·重组脂肪酶的酶学性质 | 第85-86页 |
| ·重组脂肪酶的有机溶剂耐性 | 第85页 |
| ·重组脂肪酶的最适温度及温度耐性 | 第85-86页 |
| ·重组脂肪酶的最适pH及pH耐性 | 第86页 |
| ·重组脂肪酶酶pHT43-lip3与pHT43-lip5_(D93s)酶学性质的比较 | 第86-87页 |
| 3 讨论 | 第87页 |
| 4 小结 | 第87-88页 |
| 全文总结 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-96页 |
| 致谢 | 第96-98页 |
| 攻读硕士期间发表及投稿论文情况 | 第98页 |
