| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 符号说明 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-39页 |
| 1.1 链霉菌的异源表达简介 | 第16-18页 |
| 1.2 氨肽酶N简介 | 第18-21页 |
| 1.2.1 肽酶简介 | 第18-19页 |
| 1.2.2 氨肽酶简介 | 第19-20页 |
| 1.2.3 氨肽酶N简介 | 第20-21页 |
| 1.3 核苷类抗生素简介 | 第21-23页 |
| 1.4 抗性素产生菌的抗性机制简介 | 第23-24页 |
| 1.5 抗性素的隐藏反应简介 | 第24-28页 |
| 1.6 杀稻瘟菌素生物合成的研究背景 | 第28-38页 |
| 1.6.1 杀稻瘟菌素简介 | 第28-29页 |
| 1.6.2 杀稻瘟菌素的生物合成途径研究进展 | 第29-32页 |
| 1.6.3 杀稻瘟菌素基因簇的异源表达 | 第32-34页 |
| 1.6.4 杀稻瘟菌素原始产生菌的抗性机制及成熟机制介绍 | 第34-38页 |
| 1.7 本研究的内容和目的 | 第38-39页 |
| 第二章 材料与方法 | 第39-64页 |
| 2.1 菌株、质粒和引物 | 第39-47页 |
| 2.1.1 菌株 | 第39-42页 |
| 2.1.2 质粒 | 第42-43页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第43-47页 |
| 2.2 实验材料 | 第47-50页 |
| 2.3 实验方法 | 第50-64页 |
| 2.3.1 菌种的培养及保存 | 第50-51页 |
| 2.3.2 大肠杆菌质粒的提取 | 第51页 |
| 2.3.3 链霉菌质粒的小量提取 | 第51-52页 |
| 2.3.4 大肠杆菌总DNA的少量提取 | 第52页 |
| 2.3.5 链霉菌总DNA的少量提取 | 第52页 |
| 2.3.6 聚合酶链式反应(PCR) | 第52-53页 |
| 2.3.7 DNA的酶切、回收、连接 | 第53页 |
| 2.3.8 E.coli钙转感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 2.3.9 E.coli电转感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 2.3.10 E.coli钙转感受态细胞的转化 | 第53-54页 |
| 2.3.11 大肠杆菌电转感受态细胞的转化 | 第54页 |
| 2.3.12 两亲本杂交介导的质粒DNA跨属转移 | 第54页 |
| 2.3.13 杀稻瘟菌素的液体发酵 | 第54-55页 |
| 2.3.14 杀稻瘟菌素发酵液的纯化 | 第55页 |
| 2.3.15 杀稻瘟菌素的生物活性测定 | 第55-56页 |
| 2.3.16 杀稻瘟菌素发酵液的高效液相色谱法(HPLC)测定 | 第56页 |
| 2.3.17 HPLC法测定杀稻瘟菌素BS的标准曲线 | 第56-57页 |
| 2.3.18 细胞粗提液(CFE)和全细胞的制备 | 第57页 |
| 2.3.19 LBS水解反应体系 | 第57页 |
| 2.3.20 饱和硫酸铵沉淀活性组分 | 第57-58页 |
| 2.3.21 蛋白质LC-MS/MS鉴定 | 第58页 |
| 2.3.22 PCR-targeting的方法敲除大肠杆菌基因组的基因 | 第58-59页 |
| 2.3.23 PCR-targeting的方法敲除链霉菌基因组的基因 | 第59页 |
| 2.3.24 蛋白表达及纯化 | 第59页 |
| 2.3.25 链霉菌总RNA的提取(细胞破碎法) | 第59-60页 |
| 2.3.26 链霉菌总RNA中基因组DNA的消化 | 第60页 |
| 2.3.27 RNA的反转录 | 第60页 |
| 2.3.28 链霉菌中基因的过表达 | 第60页 |
| 2.3.29 利用CRISPR/Cas9-codA(sm)系统敲除链霉菌基因组的基因 | 第60-62页 |
| 2.3.30 Western杂交 | 第62-63页 |
| 2.3.31 生物信息学分析 | 第63-64页 |
| 第三章 亮氨酰化杀稻瘟菌素(LBS)水解酶的鉴定 | 第64-83页 |
| 3.1 前言 | 第64-66页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第66-83页 |
| 3.2.1 LBS水解酶基因存在于杀稻瘟菌素(BS)基因簇之外 | 第66-69页 |
| 3.2.2 LBS水解酶基因广泛存在于微生物中 | 第69-70页 |
| 3.2.3 在E.coli DH10B中追踪水解活性组分 | 第70-74页 |
| 3.2.4 LC-MS/MS数据分析出5 个潜在的LBS水解酶 | 第74-75页 |
| 3.2.5 大场杆菌中的PepN单独负责水解LBS为 BS | 第75-77页 |
| 3.2.6 PepN的体外功能研究 | 第77-80页 |
| 3.2.7 PepN的稳定性研究 | 第80-83页 |
| 第四章 链霉菌中多组分LBS水解酶在BS成熟中的作用 | 第83-120页 |
| 4.1 前言 | 第83-84页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第84-120页 |
| 4.2.1 生物信息学功能分析,S.lividans WJ2 中有三个PepN同源蛋白 | 第84-85页 |
| 4.2.2 PepN1sli是负责LBS水解成BS的主要水解酶 | 第85-88页 |
| 4.2.3 S.lividans WJ2 中,PepN1sli的过表达能够提高BS产量 | 第88-90页 |
| 4.2.4 S.griseochromogenes中三个PepN同源蛋白的活性分析 | 第90-93页 |
| 4.2.5 S.lividans WJ2 中,三个pepN同源基因的体内敲除突变株构建 | 第93-97页 |
| 4.2.6 pepN同源基因缺失突变株的体外水解活性及发酵验证 | 第97-100页 |
| 4.2.7 生物信息学功能分析及体外活性验证,PepA具有微弱LBS水解活性 | 第100-104页 |
| 4.2.8 饱和硫酸铵沉淀的方式对LBS水解酶进一步挖掘 | 第104-120页 |
| 第五章 原始产生菌S.griseochromogenes和异源表达菌S.lividans WJ2中LBS水解酶活性对BS产量及组分的影响 | 第120-130页 |
| 5.1 前言 | 第120-122页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第122-130页 |
| 5.2.1 水解酶主组分PepN1 的体外活性差异比较 | 第122-123页 |
| 5.2.2 水解酶主组分PepN1 的稳定性比较 | 第123-124页 |
| 5.2.3 水解酶主组分PepN1 的体内活性差异比较 | 第124-127页 |
| 5.2.4 发酵过程中pH值的监测 | 第127-128页 |
| 5.2.5 Western杂交分析PepN1 的体内表达量差异 | 第128-130页 |
| 第六章 杀稻瘟菌素产量的提高 | 第130-148页 |
| 6.1 前言 | 第130-131页 |
| 6.2 结果与讨论 | 第131-148页 |
| 6.2.1 突破生物合成限速步骤,单独过表达基因簇内9 个功能基因 | 第131-135页 |
| 6.2.2 提高前体cytosine供给,单独过表达BlsMF19Y | 第135-138页 |
| 6.2.3 提高前体UDP-葡萄糖醛酸供给,单独过表达UDP-葡萄糖脱氢酶 | 第138-141页 |
| 6.2.4 提高前体Leu-tRNALeu供给,串联过表达Bls J、Bld A及 LRS | 第141-145页 |
| 6.2.5 提高中间体LDBS浓度,串联过表达BlsK、BlsJ、BldA及 LRS | 第145-148页 |
| 第七章 总结与展望 | 第148-151页 |
| 7.1 本研究工作总结 | 第148-149页 |
| 7.2 本研究主要创新点 | 第149-150页 |
| 7.3 进一步工作和展望 | 第150-151页 |
| 7.3.1 其它低活性LBS水解酶的鉴定 | 第150页 |
| 7.3.2 Fe~(2+)刺激细胞上的水解酶活性的基因的鉴定 | 第150页 |
| 7.3.3 小分子肽类次级代谢产物异源表达宿主的验证 | 第150-151页 |
| 参考文献 | 第151-163页 |
| 致谢 | 第163-165页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第165-166页 |
| 附录 | 第166-172页 |
