| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 符号说明 | 第13-15页 |
| 前言 | 第15-21页 |
| 1 立题依据 | 第15-18页 |
| 1.1 甘草药材用途广泛,需求旺盛 | 第15页 |
| 1.2 栽培甘草药材质量差异显著 | 第15页 |
| 1.3 甘草中黄酮类化合物具有重要的药理活性 | 第15-16页 |
| 1.4 功能基因多态性是影响甘草黄酮类化合物生物合成的重要分子基础 | 第16页 |
| 1.5 查尔酮异构酶是甘草中黄酮类化合物生物合成的关键酶 | 第16-18页 |
| 2 研究思路与方法 | 第18-21页 |
| 2.1 研究目标 | 第18页 |
| 2.2 研究内容 | 第18-20页 |
| 2.2.1 黄酮高/低含量组甘草样品CHI基因多态性的研究 | 第18页 |
| 2.2.2 黄酮高/低含量组主流CHI单倍型的生物信息学分析 | 第18-19页 |
| 2.2.3 转甘草特异性CHI基因毕赤酵母GS115工程菌的构建 | 第19页 |
| 2.2.4 特异性CHI蛋白的诱导表达及体外酶促反应 | 第19-20页 |
| 2.3 技术流程图 | 第20-21页 |
| 文献综述 | 第21-30页 |
| 1 甘草中黄酮类化合物的研究现状 | 第21-24页 |
| 1.1 甘草中黄酮类化合物的分类 | 第21-22页 |
| 1.2 甘草中黄酮类化合物的药理学活性 | 第22-23页 |
| 1.3 甘草中黄酮类化合物的测定方法 | 第23-24页 |
| 1.3.1 甘草总黄酮测定方法 | 第23-24页 |
| 1.3.2 甘草中各种化学成分的分析测定方法 | 第24页 |
| 2 CHI基因的研究进展 | 第24-27页 |
| 2.1 CHI基因的发现 | 第24页 |
| 2.2 CHI基因的分类 | 第24-25页 |
| 2.3 CHI的结构特点 | 第25页 |
| 2.4 CHI的催化反应机理 | 第25页 |
| 2.5 CHI的基因功能研究 | 第25-26页 |
| 2.6 甘草中CHI基因的研究概况 | 第26-27页 |
| 3 常用重组蛋白表达系统 | 第27-30页 |
| 3.1 原核表达系统 | 第27-28页 |
| 3.2 真核表达系统 | 第28-30页 |
| 3.2.1 酵母表达系统 | 第28-29页 |
| 3.2.2 毕赤酵母表达系统 | 第29-30页 |
| 第一章 甘草CHI基因多态性与4种主要黄酮类化合物含量的相关性分析 | 第30-63页 |
| 1 实验材料 | 第30-32页 |
| 1.1 植物材料 | 第30-31页 |
| 1.2 试剂 | 第31页 |
| 1.3 仪器及耗材 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-36页 |
| 2.1 甘草总RNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.2 逆转录 | 第33-34页 |
| 2.3 甘草CHI编码区的PCR扩增 | 第34页 |
| 2.4 PCR扩增片段胶回收 | 第34-35页 |
| 2.5 连接、转化及阳性克隆筛选 | 第35-36页 |
| 2.6 测序分析 | 第36页 |
| 3 实验结果 | 第36-61页 |
| 3.1 甘草总RNA提取结果 | 第36-37页 |
| 3.2 PCR扩增结果 | 第37-38页 |
| 3.3 阳性克隆筛选结果 | 第38页 |
| 3.4 测序结果及分析 | 第38-61页 |
| 3.4.1 甘草CHI单倍型分析 | 第38-47页 |
| 3.4.2 不同甘草样品中CHI序列单倍型出现频率分析 | 第47-49页 |
| 3.4.3 甘草CHI cDNA序列的聚类分析 | 第49-50页 |
| 3.4.4 甘草CHI氨基酸序列变异位点分析 | 第50-58页 |
| 3.4.5 不同甘草样品中CHI氨基酸序列出现频率分析 | 第58-60页 |
| 3.4.6 甘草CHI序列聚类分析 | 第60-61页 |
| 4 小结与讨论 | 第61-63页 |
| 第二章 黄酮高/低含量组甘草样品主流CHI序列的生物信息学分析 | 第63-71页 |
| 1 实验材料 | 第63页 |
| 2 实验方法 | 第63-64页 |
| 2.1 理化性质分析 | 第63页 |
| 2.2 二级结构预测 | 第63页 |
| 2.3 三级结构及底物结合位点分析 | 第63-64页 |
| 2.4 甘草CHI信号肽、保守结构域及跨膜结构域预测 | 第64页 |
| 2.5 CHI氨基酸序列聚类分析 | 第64页 |
| 3 实验结果 | 第64-69页 |
| 3.1 理化性质预测结果 | 第64页 |
| 3.2 二级结构预测结果分析 | 第64-65页 |
| 3.3 三级结构与底物结合情况分析 | 第65-67页 |
| 3.4 甘草CHI信号肽、保守结构域及跨膜结构域预测 | 第67-69页 |
| 4 小结与讨论 | 第69-71页 |
| 第三章 转甘草CHI基因酵母表达载体的构建 | 第71-82页 |
| 1 实验材料 | 第71-72页 |
| 1.1 菌体及质粒 | 第71页 |
| 1.2 试剂 | 第71页 |
| 1.3 仪器及耗材 | 第71-72页 |
| 2 实验方法 | 第72-76页 |
| 2.1 含甘草CHI基因的大肠杆菌工程菌活化及重组T质粒提取 | 第72-73页 |
| 2.2 表达载体PPIC9K酶切位点分析 | 第73-74页 |
| 2.3 含酶切位点的甘草CHI基因PCR引物设计及PCR反应 | 第74页 |
| 2.4 PCR产物胶回收,T连接,转化,阳性克隆筛选及测序 | 第74页 |
| 2.5 CHI基因的双酶切 | 第74-75页 |
| 2.6 目的基因与表达载体双酶切产物连接 | 第75-76页 |
| 2.7 连接产物转化、阳性克隆筛选及测序 | 第76页 |
| 3 实验结果 | 第76-81页 |
| 3.1 含酶切位点的甘草CHI基因扩增结果 | 第76-77页 |
| 3.2 含甘草CHI基因的重组T质粒提取结果 | 第77-78页 |
| 3.3 双酶切结果 | 第78-79页 |
| 3.4 连接产物阳性克隆筛选结果 | 第79页 |
| 3.5 测序结果 | 第79-81页 |
| 4 小结与讨论 | 第81-82页 |
| 第四章 转甘草CHI基因毕赤酵母GS115工程菌的构建 | 第82-93页 |
| 1 实验材料 | 第82-84页 |
| 1.1 菌株及质粒 | 第82页 |
| 1.2 试剂、溶液及培养基配制 | 第82-84页 |
| 1.3 仪器及耗材 | 第84页 |
| 2 实验方法 | 第84-88页 |
| 2.1 含甘草CHI基因的大肠杆菌工程菌活化及重组PPIC9K质粒提取 | 第84页 |
| 2.2 重组PPIC9K质粒线性化 | 第84-85页 |
| 2.3 毕赤酵母GS115感受态细胞制备 | 第85页 |
| 2.4 重组质粒转化感受态GS115 | 第85-86页 |
| 2.5 含甘草CHI基因毕赤酵母GS115菌株筛选 | 第86-88页 |
| 2.5.1 His~+重组子筛选 | 第86页 |
| 2.5.2 G418抗性筛选 | 第86页 |
| 2.5.3 Mut~+重组子筛选 | 第86-87页 |
| 2.5.4 PCR验证及测序 | 第87-88页 |
| 3 实验结果 | 第88-92页 |
| 3.1 PPIC9K-CHI重组质粒线性化结果 | 第88-89页 |
| 3.2 HIs~+重组子筛选结果 | 第89页 |
| 3.3 G418筛选结果 | 第89-90页 |
| 3.4 MUT~+重组子筛选结果 | 第90-91页 |
| 3.5 PCR验证及测序结果 | 第91-92页 |
| 4 小结与讨论 | 第92-93页 |
| 第五章 转甘草CHI基因毕赤酵母GS115工程菌的诱导表达及体外酶促反应 | 第93-116页 |
| 1 实验材料 | 第93-96页 |
| 1.1 菌株 | 第93页 |
| 1.2 试剂 | 第93-95页 |
| 1.3 仪器与耗材 | 第95-96页 |
| 2 实验方法 | 第96-104页 |
| 2.1 转甘草CHI基因酵母工程菌的活化 | 第96-97页 |
| 2.2 转甘草CHI基因酵母工程菌的诱导表达 | 第97页 |
| 2.3 诱导表达产物的浓缩 | 第97-98页 |
| 2.4 SDS-PAGE电泳检测CHI | 第98-99页 |
| 2.5 BCA法对表达产物蛋白定量 | 第99页 |
| 2.6 体外酶促反应1——以异甘草素为底物 | 第99-100页 |
| 2.7 体外酶促反应2——以柚皮素查尔酮为底物 | 第100-102页 |
| 2.8 酶促反应1的HPLC检测 | 第102-103页 |
| 2.8.1 异甘草素及甘草素色谱条件 | 第102页 |
| 2.8.2 对照品溶液的制备 | 第102页 |
| 2.8.3 数据分析 | 第102-103页 |
| 2.9 酶促反应2的HPLC检测 | 第103-104页 |
| 2.9.1 柚皮素查尔酮及柚皮素色谱条件 | 第103页 |
| 2.9.2 对照品溶液的制备 | 第103页 |
| 2.9.3 数据分析 | 第103-104页 |
| 3 实验结果 | 第104-114页 |
| 3.1 CHI蛋白诱导表达结果 | 第104页 |
| 3.2 SDS-PAGE电泳检测结果 | 第104-105页 |
| 3.3 BCA法测定蛋白含量结果 | 第105页 |
| 3.4 酶促反应1的HPLC测定结果 | 第105-110页 |
| 3.4.1 异甘草素及甘草素标准曲线的建立 | 第105-106页 |
| 3.4.2 酶促反应1中产物甘草素的含量测定结果 | 第106-109页 |
| 3.4.3 酶促反应1中甘草素含量的统计学分析 | 第109-110页 |
| 3.5 酶促反应2的HPLC测定结果 | 第110-114页 |
| 3.5.1 柚皮素查尔酮及柚皮素标准曲线的建立 | 第110页 |
| 3.5.2 酶促反应2中产物柚皮素的含量测定结果 | 第110-113页 |
| 3.5.3 酶促反应2中柚皮素含量的统计学分析 | 第113-114页 |
| 4 小结与讨论 | 第114-116页 |
| 第六章 总结与展望 | 第116-119页 |
| 1 总结 | 第116-118页 |
| 2 展望 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 在学期间主要研究成果 | 第129页 |
