猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离鉴定、毒力分析及N蛋白表达
| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 英文缩略词或符号表 | 第7-13页 |
| 1 前言 | 第13-27页 |
| 1.1 病原学 | 第13-19页 |
| 1.1.1 起源 | 第13页 |
| 1.1.2 病毒学分类 | 第13-14页 |
| 1.1.3 形态结构 | 第14-15页 |
| 1.1.4 基因组组成 | 第15-18页 |
| 1.1.5 理化性质 | 第18页 |
| 1.1.6 抗原性 | 第18-19页 |
| 1.1.7 病毒的分离与培养特性 | 第19页 |
| 1.2 PEDV流行病学 | 第19-21页 |
| 1.2.1 病原学调查 | 第19-21页 |
| 1.2.2 血清学调查 | 第21页 |
| 1.3 病毒致病性研究 | 第21-23页 |
| 1.3.1 病毒受体 | 第21页 |
| 1.3.2 传播途径 | 第21-22页 |
| 1.3.3 感染机制 | 第22页 |
| 1.3.4 临床症状 | 第22页 |
| 1.3.5 致病性 | 第22页 |
| 1.3.6 病理损伤 | 第22-23页 |
| 1.4 临床诊断 | 第23-25页 |
| 1.4.1 免疫电镜 | 第23页 |
| 1.4.2 微量血清中和试验 | 第23页 |
| 1.4.3 免疫荧光试验 | 第23页 |
| 1.4.4 ELISA检测 | 第23页 |
| 1.4.5 RT-PCR检测 | 第23-24页 |
| 1.4.6 荧光定量RT-PCR | 第24页 |
| 1.4.7 RT-LAMP检测 | 第24页 |
| 1.4.8 胶体金检测 | 第24-25页 |
| 1.5 疫苗防控 | 第25-27页 |
| 1.5.1 返饲 | 第25页 |
| 1.5.2 灭活疫苗 | 第25页 |
| 1.5.3 弱毒活疫苗 | 第25-26页 |
| 1.5.4 口服疫苗 | 第26页 |
| 1.5.5 转基因作物 | 第26页 |
| 1.5.6 重组细菌活载体疫苗 | 第26-27页 |
| 1.5.7 重组活病毒载体疫苗 | 第27页 |
| 1.6 反向遗传操作系统研究 | 第27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-46页 |
| 2.1 材料 | 第27-31页 |
| 2.1.1 病料 | 第27-28页 |
| 2.1.2 病毒 | 第28页 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 | 第28页 |
| 2.1.4 细胞培养试剂 | 第28页 |
| 2.1.5 动物回归试验所需材料 | 第28-29页 |
| 2.1.6 基因克隆和表达与纯化及其相关培养试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.7 实验相关试剂盒溶液配制 | 第30-31页 |
| 2.1.8 主要仪器及耗材 | 第31页 |
| 2.1.9 相关生物学软件 | 第31页 |
| 2.2 方法 | 第31-46页 |
| 2.2.1 样品采集与检测 | 第31-35页 |
| 2.2.2 PEDV病毒分离 | 第35-39页 |
| 2.2.3 动物回归试验 | 第39-40页 |
| 2.2.4 病毒传代 | 第40页 |
| 2.2.5 病毒N基因的原核表达 | 第40-43页 |
| 2.2.6 表达条件优化与目的蛋白鉴定 | 第43-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-71页 |
| 3.1 临床样品检测 | 第46-48页 |
| 3.1.1 临床采集样品来源 | 第46-47页 |
| 3.1.2 临床采集样品3重RT-PCR检测 | 第47页 |
| 3.1.3 临床样品野毒与疫苗毒RT-PCR鉴定 | 第47-48页 |
| 3.2 病毒的分离 | 第48-58页 |
| 3.2.1 接种细胞后产生的CPE | 第48页 |
| 3.2.2 临床样品经细胞培养后的PEDV检测 | 第48-49页 |
| 3.2.3 细胞培养的PEDV野毒与疫苗毒鉴定 | 第49页 |
| 3.2.4 S基因高变区扩增与测序分析 | 第49-50页 |
| 3.2.5 全长引物设计与合成 | 第50页 |
| 3.2.6 全基因组扩增 | 第50页 |
| 3.2.7 序列测定结果 | 第50-51页 |
| 3.2.8 序列相似性和系统发育进化树结果 | 第51-58页 |
| 3.3 动物回归试验 | 第58-62页 |
| 3.3.1 种毒的制备及纯粹性检测 | 第58-59页 |
| 3.3.2 野毒与疫苗毒鉴别 | 第59-60页 |
| 3.3.3 种毒滴度的测定 | 第60页 |
| 3.3.4 仔猪外源病原检测 | 第60页 |
| 3.3.5 仔猪临床发病特征及剖检病变 | 第60-61页 |
| 3.3.6 攻毒后仔猪检测 | 第61-62页 |
| 3.3.7 数据统计 | 第62页 |
| 3.4 病毒传代分析 | 第62-65页 |
| 3.4.1 ZH02毒株在Vero细胞传代 | 第62-63页 |
| 3.4.2 TCID50测定 | 第63页 |
| 3.4.3 全基因组测定 | 第63-64页 |
| 3.4.4 与亲代毒株序列比较 | 第64-65页 |
| 3.5 表达载体构建 | 第65-67页 |
| 3.5.1 N基因扩增 | 第65-66页 |
| 3.5.2 表达载体和扩增子双酶切 | 第66页 |
| 3.5.3 测序验证 | 第66-67页 |
| 3.5.4 重组质粒转化表达菌PCR检测 | 第67页 |
| 3.6 N基因的原核表达 | 第67-71页 |
| 3.6.1 温度优化 | 第67-68页 |
| 3.6.2 诱导表达最佳时间 | 第68页 |
| 3.6.3 IPTG浓度的优化 | 第68-69页 |
| 3.6.4 目的蛋白可溶性分析 | 第69-70页 |
| 3.6.5 重组蛋白的鉴定 | 第70-71页 |
| 3.6.6 Ni柱纯化 | 第71页 |
| 4 讨论 | 第71-76页 |
| 4.1 临床样品检测分析 | 第71-72页 |
| 4.2 PEDV病毒的分离 | 第72-74页 |
| 4.3 攻毒试验 | 第74-75页 |
| 4.4 传代致弱分析 | 第75页 |
| 4.5 原核表达 | 第75-76页 |
| 5 全文总结 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-85页 |
| 附录A：全长引物序列表 | 第85-87页 |
| 附录B：GenBank数据库中选取的参考毒株表 | 第87-89页 |
| 附录C：硕士期间发表论文 | 第89页 |
