| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 符号与缩略语说明 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-34页 |
| 1 麦草畏的简介 | 第18-19页 |
| 1.1 麦草畏的化学性质 | 第18-19页 |
| 1.2 麦草畏的除草机制 | 第19页 |
| 2 耐麦草畏转基因作物的应用前景 | 第19-23页 |
| 2.1 抗除草剂转基因作物的应用 | 第19-22页 |
| 2.2 麦草畏的转基因作物研究 | 第22-23页 |
| 3 麦草畏的微生物降解研究 | 第23-27页 |
| 3.1 麦草畏降解菌株及降解途径的研究 | 第23-24页 |
| 3.2 麦草畏脱甲基酶和基因的研究 | 第24-27页 |
| 4 5,10-亚甲基甲基四氢叶酸还原酶的功能研究 | 第27-30页 |
| 5 本论文研究目的和意义 | 第30-32页 |
| 6 研究的技术路线 | 第32-34页 |
| 第二部分 实验部分 | 第34-104页 |
| 第一章 四氢叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt50和dmt66的克隆和功能验证 | 第34-70页 |
| 1 材料与方法 | 第34-51页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第34-35页 |
| 1.2 菌株、质粒与培养条件 | 第35-36页 |
| 1.3 所用引物 | 第36-38页 |
| 1.4 菌株Ndbn-20的活化和形态特征及生理生化鉴定 | 第38-41页 |
| 1.4.1 菌株Ndbn-20的活化 | 第38页 |
| 1.4.2 菌株Ndbn-20的形态特征及生理生化鉴定 | 第38-39页 |
| 1.4.3 菌株Ndbn-20的16S rRNA基因序列分析 | 第39-40页 |
| 1.4.3.1 菌株的总DNA提取 | 第39页 |
| 1.4.3.2 菌株的16S rRNA基因的PCR扩增 | 第39-40页 |
| 1.4.3.3 16S rRNA PCR产物的T/A克隆、酶连和转化 | 第40页 |
| 1.4.3.4 16S rRNA基因序列测定 | 第40页 |
| 1.4.4 菌株的系统发育树构建和分析 | 第40-41页 |
| 1.5 经活化鉴定后菌株Ndbn-20对麦草畏的降解特性验证 | 第41页 |
| 1.6 菌株基因组测序 | 第41-42页 |
| 1.6.1 样品送检与测序 | 第41页 |
| 1.6.2 基因组的组装与基因注释 | 第41-42页 |
| 1.7 脱甲基酶基因的查找和生物信息学分析 | 第42页 |
| 1.8 脱甲基酶基因簇的功能验证 | 第42-44页 |
| 1.8.1 互补序列的PCR扩增 | 第43页 |
| 1.8.2 PCR产物和质粒的双酶切、产物纯化和酶连 | 第43-44页 |
| 1.8.3 酶连产物转化和阳性转化子的筛选 | 第44页 |
| 1.8.4 重组菌株的功能验证 | 第44页 |
| 1.9 脱甲基酶基因簇上各基因在麦草畏诱导条件下的转录 | 第44-48页 |
| 1.9.1 RNA的提取 | 第45-46页 |
| 1.9.2 反转录PCR | 第46-47页 |
| 1.9.3 实时荧光定量PCR | 第47-48页 |
| 1.9.4 荧光定量PCR数据处理与分析 | 第48页 |
| 1.10 脱甲基酶基因dmt的敲除 | 第48-51页 |
| 1.10.1 同源重组载体的构建 | 第49-50页 |
| 1.10.2 三亲接合和同源重组突变菌株筛选 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-68页 |
| 2.1 活化的Ndbn-20的菌落形态观察和系统发育树分析 | 第51-52页 |
| 2.1.1 Ndbn-20的菌落形态观察 | 第51页 |
| 2.1.2 Ndbn-20的系统发育树分析 | 第51-52页 |
| 2.2 Ndbn-20对麦草畏的降解特性验证 | 第52-54页 |
| 2.3 菌株Sphingomonas sp. Ndbn-20的基因组测序和脱甲基酶基因寻找 | 第54-62页 |
| 2.3.1 菌株的基因组测序 | 第54-57页 |
| 2.3.1.1 DNA样品检测 | 第55-56页 |
| 2.3.1.2 DNA样品建库测序 | 第56-57页 |
| 2.3.1.3 数据组装 | 第57页 |
| 2.3.2 脱甲基酶基因的查找及生物信息学预测 | 第57-62页 |
| 2.3.2.1 脱甲基酶基因的查找 | 第57-59页 |
| 2.3.2.2 脱甲基酶基因的生物信息学预测 | 第59-61页 |
| 2.3.2.3 dmt02、dmt50和dmt66的启动子分析 | 第61-62页 |
| 2.4 脱甲基酶基因和基因簇的功能验证 | 第62-63页 |
| 2.5 实时荧光定量PCR | 第63-67页 |
| 2.5.1 RNA的提取 | 第63-64页 |
| 2.5.2 RNA反转录和cDNA的检测 | 第64页 |
| 2.5.3 实时荧光定量PCR反应 | 第64-65页 |
| 2.5.4 scaffold 50和scaffold 66上各4个基因的转录元件研究 | 第65-67页 |
| 2.6 脱甲基酶基因dmt的敲除 | 第67-68页 |
| 本章讨论 | 第68-69页 |
| 本章小结 | 第69-70页 |
| 第二章 Ndbn-20中脱甲基酶Dmt50和Dmt66的表达、纯化和酶学特性研究 | 第70-90页 |
| 1 材料和方法 | 第70-76页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第70页 |
| 1.2 菌株、质粒和引物 | 第70-71页 |
| 1.3 脱甲基酶表达载体的构建 | 第71-73页 |
| 1.3.1 dmt02、dmt50和dmt66的PCR扩增 | 第72-73页 |
| 1.3.2 PCR产物和pET 29a(+)的双酶切、产物纯化和酶连 | 第73页 |
| 1.3.3 酶连产物转化和阳性转化子的筛选 | 第73页 |
| 1.4 目标蛋白Dmt的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第73-74页 |
| 1.4.1 粗酶样品的制备 | 第73页 |
| 1.4.2 目的蛋白的纯化 | 第73-74页 |
| 1.4.3 蛋白透析与保存 | 第74页 |
| 1.4.4 目的蛋白含量的测定 | 第74页 |
| 1.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第74页 |
| 1.5.1 样品处理 | 第74页 |
| 1.5.2 SDS-PAGE凝胶的灌制 | 第74页 |
| 1.5.3 蛋白凝胶电泳 | 第74页 |
| 1.5.4 蛋白凝胶的染色与脱色 | 第74页 |
| 1.6 酶的功能鉴定 | 第74-75页 |
| 1.6.1 麦草畏脱甲基酶活性的测定 | 第74-75页 |
| 1.6.2 酶促反应的产物检测与鉴定 | 第75页 |
| 1.7 酶学特性的研究 | 第75-76页 |
| 1.7.1 温度对酶活力的影响 | 第75页 |
| 1.7.2 pH对酶活力的影响 | 第75页 |
| 1.7.3 金属离子对酶活力的影响 | 第75-76页 |
| 1.8 产物对脱甲基酶活性的反馈抑制研究 | 第76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-87页 |
| 2.1 Dmt的异源表达和纯化 | 第76-78页 |
| 2.1.1 PCR扩增dmt基因 | 第76页 |
| 2.1.2 Dmt基因表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 2.1.3 脱甲基酶Dmt的纯化 | 第77-78页 |
| 2.2 Dmt的功能验证 | 第78-81页 |
| 2.3 环境条件对酶活力的影响 | 第81-84页 |
| 2.3.1 温度对酶活力的影响 | 第81-82页 |
| 2.3.2 pH对酶活力的影响 | 第82-83页 |
| 2.3.3 金属离子对酶活力的影响 | 第83-84页 |
| 2.4 中间产物对脱甲基酶活性的反馈抑制研究 | 第84-87页 |
| 本章讨论 | 第87-89页 |
| 本章小结 | 第89-90页 |
| 第三章 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因mthfr66表达和功能初步研究 | 第90-104页 |
| 1 材料和方法 | 第90-94页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第90页 |
| 1.2 菌株、质粒和引物 | 第90-92页 |
| 1.3 编码Mthfr的基因克隆 | 第92页 |
| 1.3.1 菌株DNA的提取 | 第92页 |
| 1.3.2 编码Mthfr的基因的PCR扩增 | 第92页 |
| 1.4 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶Mthfr的表达载体的构建 | 第92页 |
| 1.5 目标蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第92页 |
| 1.6 Mthfr66的功能鉴定 | 第92-93页 |
| 1.6.1 Mthfr66对5-甲基四氢叶酸的催化作用测定 | 第92-93页 |
| 1.6.2 Mthf166与其它四个Mthfr的功能比较 | 第93页 |
| 1.6.3 酶促反应的产物检测与鉴定 | 第93页 |
| 1.7 Mthfr66的酶学特性研究 | 第93-94页 |
| 1.7.1 温度对Mthfr66酶活力的影响 | 第93页 |
| 1.7.2 pH对Mthfr66酶活力的影响 | 第93页 |
| 1.7.3 金属离子对Mthfr66酶活力的影响 | 第93-94页 |
| 2 结果与分析 | 第94-102页 |
| 2.1 不同菌株中的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(Mthfr)的氨基酸进化树分析 | 第94页 |
| 2.2 Mthfr的异源表达和纯化 | 第94-95页 |
| 2.2.1 PCR扩增编码Mthfr的基因 | 第94-95页 |
| 2.2.2 五个5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶Mthfr的纯化 | 第95页 |
| 2.3 Mthfr的功能验证 | 第95-100页 |
| 2.3.1 Mthfr66对5-甲基四氢叶酸的催化作用 | 第95-99页 |
| 2.3.2 其他四个Mthfr对麦草畏和5-methyl-THF的催化作用 | 第99-100页 |
| 2.4 环境条件对Mthfr66酶活力的影响 | 第100-102页 |
| 2.4.1 温度对Mthfr66酶活力的影响 | 第100页 |
| 2.4.2 pH对Mthfr66酶活力的影响 | 第100-101页 |
| 2.4.3 金属离子对Mthfr66酶活力的影响 | 第101-102页 |
| 本章讨论 | 第102-103页 |
| 本章小结 | 第103-104页 |
| 全文结论 | 第104-106页 |
| 主要创新点 | 第106-108页 |
| 今后展望 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-118页 |
| 附录 | 第118-126页 |
| 附录一 转基因拟南芥植株的麦草畏耐受性效果检测 | 第118-119页 |
| 附录二 培养基与试剂配方 | 第119-121页 |
| 附录三 dmt02序列 | 第121-122页 |
| 附录四 dmt50序列 | 第122-123页 |
| 附录五 dmt66序列 | 第123-124页 |
| 附录六 Mthfr66序列 | 第124-126页 |
| 博士期间论文的发表和专利的申请 | 第126-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
