| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略表 | 第15-17页 |
| 1 文献综述 | 第17-25页 |
| 1.1 鸡球虫病和鸡球虫 | 第17-18页 |
| 1.2 鸡球虫的分离、鉴定和纯化技术 | 第18-19页 |
| 1.2.1 鸡球虫的分离技术 | 第18页 |
| 1.2.2 鸡球虫的鉴定方法 | 第18-19页 |
| 1.2.3 鸡球虫单卵囊纯化技术 | 第19页 |
| 1.3 RAPD在鸡球虫遗传多态性研究中的应用 | 第19-20页 |
| 1.4 鸡球虫生活周期表达不同抗原研究进展 | 第20-21页 |
| 1.4.1 鸡球虫各生活周期分泌的抗原物质 | 第20-21页 |
| 1.4.2 鸡球虫表面抗原的研究进展 | 第21页 |
| 1.5 鸡球虫感染免疫应答研究进展 | 第21-23页 |
| 1.5.1 细胞免疫 | 第21-22页 |
| 1.5.2 体液免疫 | 第22页 |
| 1.5.3 细胞因子的作用 | 第22-23页 |
| 1.6 鸡球虫疫苗研究进展 | 第23-25页 |
| 1.6.1 活疫苗 | 第23-24页 |
| 1.6.2 基因工程疫苗 | 第24-25页 |
| 1.6.3 活载体疫苗 | 第25页 |
| 2 湖北省E.tenella的鉴定和遗传多态性研究 | 第25-42页 |
| 2.1 前言 | 第25-26页 |
| 2.2 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.2.1 实验动物和球虫样品 | 第26页 |
| 2.2.2 球虫鉴定ITS1引物 | 第26页 |
| 2.2.3 RAPD分析的随机引物 | 第26-28页 |
| 2.2.4 主要仪器和试剂 | 第28页 |
| 2.2.5 主要溶液的配制 | 第28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-33页 |
| 2.3.1 粪便中球虫卵囊的收集 | 第28-30页 |
| 2.3.2 球虫卵囊孢子化 | 第30页 |
| 2.3.3 球虫卵囊计数 | 第30页 |
| 2.3.4 E.tenalla虫株单卵囊纯化和增殖 | 第30-31页 |
| 2.3.5 球虫基因组的提取 | 第31页 |
| 2.3.6 E.tenalla虫株鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.7 E.tenalla野生株RAPD分析 | 第32-33页 |
| 2.4 结果与分析 | 第33-40页 |
| 2.4.1 E.tenella野生株形态学鉴定 | 第33-34页 |
| 2.4.2 E.tenella野生株ITS1特异性鉴定 | 第34-35页 |
| 2.4.3 E.tenella虫株ITS1序列同源性比对 | 第35-36页 |
| 2.4.4 球虫ITS1系统进化分析 | 第36-37页 |
| 2.4.5 E.tenalla野生株RAPD多态性扩增结果和遗传多态性分析 | 第37-40页 |
| 2.5 讨论 | 第40-42页 |
| 3 E.tenalla表面抗原基因EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22克隆和原核表达 | 第42-67页 |
| 3.1 前言 | 第42页 |
| 3.2 材料和方法 | 第42-46页 |
| 3.2.1 实验动物和虫株 | 第42页 |
| 3.2.2 实验所需要的引物 | 第42-43页 |
| 3.2.3 主要仪器和试剂 | 第43-44页 |
| 3.2.4 主要培养基和溶液的配制 | 第44-45页 |
| 3.2.5 菌株和质粒 | 第45-46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-55页 |
| 3.3.1 E.tenella野生株总RNA提取和cDNA的制备 | 第46-47页 |
| 3.3.2 表面抗原基因EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22的克隆 | 第47-48页 |
| 3.3.2.1 氨基酸序列的生物信息学分析 | 第47-48页 |
| 3.3.2.2 编码序列的PCR扩增 | 第48页 |
| 3.3.3 重组原核表达质粒的构建 | 第48-49页 |
| 3.3.3.1 截短目的基因的PCR扩增 | 第48-49页 |
| 3.3.3.2 PCR产物的回收纯化 | 第49页 |
| 3.3.3.3 回收片段与pET28a载体的连接 | 第49页 |
| 3.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第49-50页 |
| 3.3.4.1 大肠杆菌化学感受态细胞的制备 | 第49-50页 |
| 3.3.4.2 连接产物的转化 | 第50页 |
| 3.3.5 质粒的鉴定及测序 | 第50-51页 |
| 3.3.6 碱裂解法小量提取质粒 | 第51页 |
| 3.3.7 EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622蛋白表达 | 第51-54页 |
| 3.3.7.1 诱导表达 | 第51-52页 |
| 3.3.7.2 SDS-PAGE电泳 | 第52页 |
| 3.3.7.3 蛋白表达形式的检测 | 第52-53页 |
| 3.3.7.4 表达产物的大量提取 | 第53页 |
| 3.3.7.5 蛋白的透析与浓缩 | 第53-54页 |
| 3.3.7.6 BCA法测定蛋白浓度 | 第54页 |
| 3.3.8 E.tenella多克隆抗体的制备 | 第54页 |
| 3.3.9 Western blot | 第54-55页 |
| 3.4 结果与分析 | 第55-64页 |
| 3.4.1 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22编码基因的克隆和分析 | 第55-58页 |
| 3.4.1.1 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22编码基因的克隆 | 第55-56页 |
| 3.4.1.2 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22编码序列分析 | 第56页 |
| 3.4.1.3 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22截短编码序列的扩增 | 第56-58页 |
| 3.4.2 重组原核表达质粒的构建和鉴定 | 第58-59页 |
| 3.4.3 EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的原核表达 | 第59-61页 |
| 3.4.4 检测EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622蛋白表达 | 第61-64页 |
| 3.5 讨论 | 第64-67页 |
| 4 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22的真核表达 | 第67-82页 |
| 4.1 前言 | 第67页 |
| 4.2 实验材料 | 第67-70页 |
| 4.2.1 球虫虫株和细胞 | 第67页 |
| 4.2.2 实验所需要的引物 | 第67-68页 |
| 4.2.3 主要仪器和试剂 | 第68页 |
| 4.2.4 主要培养基和溶液的配制 | 第68-69页 |
| 4.2.5 菌株和质粒 | 第69-70页 |
| 4.3 实验方法 | 第70-74页 |
| 4.3.1 重组真核表达质粒的构建 | 第70页 |
| 4.3.1.1 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22部分编码序列的PCR扩增 | 第70页 |
| 4.3.1.2 PCR产物的回收及纯化 | 第70页 |
| 4.3.1.3 回收片段与真核载体pEGFP-N1的连接 | 第70页 |
| 4.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第70页 |
| 4.3.2.1 大肠杆菌化学感受态细胞的制备 | 第70页 |
| 4.3.2.2 连接产物的转化 | 第70页 |
| 4.3.3 质粒的鉴定及测序 | 第70-71页 |
| 4.3.4 碱裂解法小量提取质粒 | 第71页 |
| 4.3.5 去内毒素重组真核质粒的大量提取 | 第71-72页 |
| 4.3.6 哺乳动物细胞的培养和转染 | 第72-74页 |
| 4.3.6.1 哺乳动物细胞的复苏 | 第72页 |
| 4.3.6.2 哺乳动物细胞的传代培养 | 第72页 |
| 4.3.6.3 哺乳动物细胞的冻存 | 第72-73页 |
| 4.3.6.4 哺乳动物细胞的转染 | 第73页 |
| 4.3.6.5 细胞收集及RT-PCR方法验证重组真核质粒在细胞中表达 | 第73页 |
| 4.3.6.6 细胞蛋白的收集 | 第73-74页 |
| 4.3.6.7 Westernblot | 第74页 |
| 4.4 结果与分析 | 第74-79页 |
| 4.4.1 EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22部分编码序列的PCR扩增 | 第74-75页 |
| 4.4.2 重组真核表达质粒的构建和鉴定 | 第75-76页 |
| 4.4.3 重组真核表达质粒在293T细胞中表达 | 第76-77页 |
| 4.4.4 RT-PCR方法验证重组真核表达质粒在293T细胞中的表达 | 第77-78页 |
| 4.4.5 Westernblot验证重组真核表达质粒在293T细胞中的表达 | 第78-79页 |
| 4.5 讨论 | 第79-82页 |
| 5 EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的免疫保护性实验 | 第82-107页 |
| 5.1 前言 | 第82页 |
| 5.2 实验材料 | 第82-83页 |
| 5.2.1 实验动物和球虫虫株 | 第82页 |
| 5.2.2 主要仪器和试剂 | 第82-83页 |
| 5.2.3 主要培养基和溶液的配制 | 第83页 |
| 5.2.4 菌株和质粒 | 第83页 |
| 5.3 实验方法 | 第83-87页 |
| 5.3.1 EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622蛋白提取 | 第83页 |
| 5.3.2 EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622真核质粒提取 | 第83页 |
| 5.3.3 动物实验 | 第83-87页 |
| 5.3.3.1 动物实验分组 | 第83-84页 |
| 5.3.3.2 动物实验方案 | 第84-85页 |
| 5.3.3.3 检测实验动物血液中细胞因子水平和IgY浓度 | 第85-86页 |
| 5.3.3.4 免疫保护效果评估 | 第86-87页 |
| 5.4 结果与分析 | 第87-102页 |
| 5.4.1 实验动物血液细胞因子浓度和IgY浓度测定 | 第88-98页 |
| 5.4.1.1 IFN-γ浓度 | 第88-90页 |
| 5.4.1.2 IL-4浓度 | 第90-92页 |
| 5.4.1.3 IL-10浓度 | 第92-93页 |
| 5.4.1.4 IL-17浓度 | 第93-96页 |
| 5.4.1.5 IgY浓度 | 第96-98页 |
| 5.4.2 试验动物增重和相对增重率 | 第98-99页 |
| 5.4.3 实验动物病变计分、克粪便卵囊产量和卵囊产量下降率 | 第99-101页 |
| 5.4.4 动物实验抗球虫指数 | 第101-102页 |
| 5.5 讨论 | 第102-107页 |
| 结论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-122页 |
| 致谢 | 第122-124页 |
