| 致谢 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩写词 | 第11-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-20页 |
| 1.1 Fam49b基因的研究背景 | 第13-14页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统的概况 | 第14-18页 |
| 1.2.1 基因组编辑技术的发展 | 第14-15页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统的结构 | 第15页 |
| 1.2.3 Ⅱ型CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9基因组编辑技术的应用 | 第16-17页 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas9技术的存在问题与展望 | 第17-18页 |
| 1.3 肿瘤发生和胚胎发育过程中的细胞增殖 | 第18-19页 |
| 1.4 本研究的目的、内容和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 材料和方法 | 第20-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-24页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第20-21页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.3 常用溶液和培养基 | 第22页 |
| 2.1.4 主要抗体 | 第22-23页 |
| 2.1.5 主要引物 | 第23页 |
| 2.1.6 菌种和质粒 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-37页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第24-25页 |
| 2.2.2 RT-PCR实验 | 第25-27页 |
| 2.2.3 Western Blot实验 | 第27-28页 |
| 2.2.4 细胞免疫荧光实验 | 第28-29页 |
| 2.2.5 基因打靶位点设计 | 第29页 |
| 2.2.6 引物设计 | 第29页 |
| 2.2.7 载体构建 | 第29-31页 |
| 2.2.8 细胞转染 | 第31-32页 |
| 2.2.9 打靶活性检测方法 | 第32页 |
| 2.2.10 有限稀释法建立单克隆细胞株 | 第32-33页 |
| 2.2.11 突变细胞系中Fam49b转录本的鉴定 | 第33页 |
| 2.2.12 细胞周期的检测 | 第33-34页 |
| 2.2.13 细胞凋亡的检测 | 第34-35页 |
| 2.2.14 细胞计数法绘制细胞生长曲线 | 第35页 |
| 2.2.15 连续五天细胞生长情况的观察和记录 | 第35页 |
| 2.2.16 CCK-8法绘制细胞生长曲线 | 第35页 |
| 2.2.17 流式细胞分选仪分选U251细胞 | 第35-36页 |
| 2.2.18 统计学分析 | 第36-37页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第37-59页 |
| 3.1 人类细胞中Fam49b基因的表达 | 第37页 |
| 3.2 人类Fam49b的基因结构分析及其CRISPR/Cas9靶位点的设计 | 第37-40页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9系统的载体构建 | 第40-41页 |
| 3.4 打靶效率的检测 | 第41-43页 |
| 3.5 突变细胞系的构建 | 第43-46页 |
| 3.5.1 单细胞克隆的筛选 | 第43-44页 |
| 3.5.2 对7号单细胞克隆基因型的鉴定 | 第44-46页 |
| 3.5.3 7号细胞株为单一细胞来源的验证 | 第46页 |
| 3.6 7号细胞株中人Fam49b基因表达情况的进一步研究 | 第46-50页 |
| 3.6.1 7号细胞株中Fam49b蛋白的检测和Fam49b转录本的研究 | 第46-47页 |
| 3.6.2 人类Fam49b基因的新异构体 | 第47-50页 |
| 3.7 敲除Fam49b1异构体对HEK293T细胞的生物学特性的影响 | 第50-54页 |
| 3.7.1 敲除Fam49b1对293T细胞的细胞形态、细胞周期和细胞凋亡的影响 | 第50-52页 |
| 3.7.2 敲除Fam49b1对细胞增殖能力的影响 | 第52-54页 |
| 3.8 人神经胶质瘤细胞系U251中CRISPR/Cas9系统的应用 | 第54-59页 |
| 3.8.1 pX458-T2打靶载体的构建与活性验证 | 第54-57页 |
| 3.8.2 运用流式细胞分选术获得高突变率U251细胞系 | 第57-59页 |
| 第四章 讨论 | 第59-65页 |
| 4.1 对CRISPR/Cas9技术的合理应用 | 第59-60页 |
| 4.2 关于在细胞水平利用CRISPR/Cas9技术进行功能缺失研究 | 第60-61页 |
| 4.3 人类Fam49b基因的选择性剪接异构体 | 第61-63页 |
| 4.3.1 新异构体Fam49b2的发现及其与Fam49b1的比较分析 | 第61-62页 |
| 4.3.2 新异构体的发现对Fam49基因家族的意义 | 第62-63页 |
| 4.4 人类细胞中Fam49b基因的功能 | 第63-64页 |
| 4.5 总结与展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 作者简历 | 第71页 |
