| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-31页 |
| 1.1 L-苹果酸的研究现状 | 第17-19页 |
| 1.1.1 L-苹果酸的应用 | 第17页 |
| 1.1.2 L-苹果酸的生产方式 | 第17-19页 |
| 1.2 富马酸酶概述 | 第19-23页 |
| 1.2.1 富马酸酶的分类 | 第20页 |
| 1.2.2 Ⅱ类富马酸酶的结构 | 第20-22页 |
| 1.2.3 富马酸酶热稳定性的研究现状 | 第22-23页 |
| 1.3 酶的分子改造技术 | 第23-28页 |
| 1.3.1 定向进化技术 | 第24-26页 |
| 1.3.1.1 突变文库的构建方法 | 第24-26页 |
| 1.3.1.2 定向进化文库的筛选方法 | 第26页 |
| 1.3.2 理性设计 | 第26-27页 |
| 1.3.3 半理性设计 | 第27-28页 |
| 1.4 课题的研究的目标与内容 | 第28-31页 |
| 1.4.1 研究目标 | 第28-29页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第29-31页 |
| 第二章 用于改造的富马酸酶的选择 | 第31-51页 |
| 2.1 引言 | 第31-32页 |
| 2.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第32页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第32-33页 |
| 2.2.3 主要设备与仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.4 培养基 | 第34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-41页 |
| 2.3.1 基因组的提取 | 第34页 |
| 2.3.2 质粒的提取 | 第34页 |
| 2.3.3 感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 2.3.4 PCR产物的纯化 | 第34页 |
| 2.3.5 酶切产物的纯化 | 第34页 |
| 2.3.6 重组菌的的构建 | 第34-37页 |
| 2.3.7 重组菌的诱导表达 | 第37页 |
| 2.3.8 细胞破碎及蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 2.3.8.1 大肠杆菌的超声破碎 | 第37页 |
| 2.3.8.2 蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 2.3.9 SDS-PAGE检测蛋白 | 第38-39页 |
| 2.3.10 蛋白浓度的测定 | 第39页 |
| 2.3.11 FumC酶学性质的测定 | 第39-41页 |
| 2.3.12 固定化重组菌对底物的转化率及其稳定性 | 第41页 |
| 2.3.12.1 大肠杆菌的固定化 | 第41页 |
| 2.3.12.2 EEF与EGF对富马酸二钠的转化率的测定 | 第41页 |
| 2.3.12.3 固定化重组菌的稳定性 | 第41页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第41-49页 |
| 2.4.1 三种FumC基因的密码子优化 | 第41-42页 |
| 2.4.2 重组菌的构建 | 第42-44页 |
| 2.4.2.1 ecfumC与cgfumC序列克隆 | 第42页 |
| 2.4.2.2 重组质粒的构建 | 第42-44页 |
| 2.4.2.3 重组菌的构建 | 第44页 |
| 2.4.3 重组大肠杆菌的的诱导表达 | 第44-45页 |
| 2.4.4 五种FumC的粗酶酶活与纯酶比酶活的测定 | 第45-47页 |
| 2.4.4.1 五种FumC的粗酶酶活的测定 | 第45-46页 |
| 2.4.4.2 五种FumC的纯酶比酶活的测定 | 第46-47页 |
| 2.4.5 EEF与EGF对底物富马酸二钠的转化率 | 第47-48页 |
| 2.4.6 固定化重组菌的稳定性 | 第48-49页 |
| 2.5 小结 | 第49-51页 |
| 第三章 来源于谷氨酸棒状杆菌的FumC的热稳定性的改造 | 第51-77页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第51-52页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第51页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第51-52页 |
| 3.2.3 主要器材 | 第52页 |
| 3.3 实验方法 | 第52-62页 |
| 3.3.1 高通量筛选方法的建立 | 第52-53页 |
| 3.3.2 突变体的复筛方法 | 第53页 |
| 3.3.3 EGF的定向进化 | 第53-55页 |
| 3.3.3.1 易错PCR方法构建突变体文库 | 第53-55页 |
| 3.3.3.2 突变文库的筛选 | 第55页 |
| 3.3.4 EGF的半理性设计 | 第55-61页 |
| 3.3.4.1 基于蛋白质序列同源性的定点突变 | 第55-58页 |
| 3.3.4.2 组合突变 | 第58页 |
| 3.3.4.3 基于结构知识的定点饱和突变 | 第58-61页 |
| 3.3.5 酶学性质的测定 | 第61-62页 |
| 3.3.5.1 酶动力学参数的测定 | 第61页 |
| 3.3.5.2 热稳定性的考察 | 第61页 |
| 3.3.5.3 最适反应温度的测定 | 第61-62页 |
| 3.3.5.4 最适反应pH的测定 | 第62页 |
| 3.4 结果与分析 | 第62-75页 |
| 3.4.1 高通量筛选方法的建立 | 第62-64页 |
| 3.4.2 突变体复筛的检测方法 | 第64页 |
| 3.4.3 EGF的定向进化 | 第64-66页 |
| 3.4.3.1 定向进化突变文库的构建 | 第64-66页 |
| 3.4.3.2 定性进化突变文库的筛选 | 第66页 |
| 3.4.4 EGF的半理性设计 | 第66-69页 |
| 3.4.4.1 基于蛋白质序列同源性的定点突变 | 第66-69页 |
| 3.4.4.2 组合突变 | 第69页 |
| 3.4.4.3 基于结构知识的定点饱和突变 | 第69页 |
| 3.4.5 EGF及其突变体的酶学性质 | 第69-72页 |
| 3.4.5.1 酶动力学参数的测定 | 第69-70页 |
| 3.4.5.2 热稳定性的考察 | 第70-71页 |
| 3.4.5.3 最适反应温度 | 第71页 |
| 3.4.5.4 最适反应pH | 第71-72页 |
| 3.4.6 位点分析 | 第72-75页 |
| 3.5 小结 | 第75-77页 |
| 第四章 来源于大肠杆菌的FumC的热稳定性的改造 | 第77-91页 |
| 4.1 引言 | 第77页 |
| 4.2 实验材料 | 第77页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第77页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第77页 |
| 4.2.3 主要器材 | 第77页 |
| 4.3 实验方法 | 第77-81页 |
| 4.3.1 EEF的定向进化 | 第78-79页 |
| 4.3.1.1 易错PCR方法构建突变体文库 | 第78页 |
| 4.3.1.2 M11T与A280T的定点突变 | 第78-79页 |
| 4.3.2 EEF的理性设计 | 第79页 |
| 4.3.2.1 改造位点的选取 | 第79页 |
| 4.3.2.2 突变子的构建 | 第79页 |
| 4.3.2.3 突变子的筛选 | 第79页 |
| 4.3.3 EEF的半理性设计 | 第79-81页 |
| 4.3.4 突变酶的酶学性质的测定 | 第81页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第81-89页 |
| 4.4.1 EEF的定向进化 | 第81-83页 |
| 4.4.2 EEF的理性设计 | 第83-85页 |
| 4.4.2.1 改造位点的选取 | 第83-85页 |
| 4.4.2.2 突变子的构建 | 第85页 |
| 4.4.2.3 突变子的筛选 | 第85页 |
| 4.4.3 EEF的半理性设计 | 第85页 |
| 4.4.4 EEF及其突变体的酶学性质 | 第85-87页 |
| 4.4.4.1 酶动力学参数 | 第86页 |
| 4.4.4.2 热稳定性的考察 | 第86页 |
| 4.4.4.3 最适反应温度 | 第86-87页 |
| 4.4.4.4 最适反应pH | 第87页 |
| 4.4.5 位点分析 | 第87-89页 |
| 4.5 小结 | 第89-91页 |
| 第五章 结论与展望 | 第91-95页 |
| 5.1 结论 | 第91-93页 |
| 5.2 展望 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-103页 |
| 附录 | 第103-111页 |
| 作者简介 | 第111页 |
