| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 目录 | 第10-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-24页 |
| 1.1 苯丙氨酸解氨酶的发现 | 第13-14页 |
| 1.2 苯丙氨酸解氨酶研究进展 | 第14-23页 |
| 1.2.1 PAL分布与定位 | 第14页 |
| 1.2.2 PAL的酶学性质 | 第14-15页 |
| 1.2.3 PAL基因 | 第15-17页 |
| 1.2.4 PAL对植物生理代谢的意义 | 第17-19页 |
| 1.2.5 PAL的应用价值 | 第19-20页 |
| 1.2.6 PAL的生产方法 | 第20-22页 |
| 1.2.7 体外载体构建技术 | 第22-23页 |
| 1.3 课题研究的内容和意义 | 第23-24页 |
| 2 苯丙氨酸解氨酶PAL的基因克隆与生物信息学分析 | 第24-40页 |
| 2.1 材料 | 第24-26页 |
| 2.1.1 种子 | 第24页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.3 工具酶 | 第25页 |
| 2.1.4 培养基与常用溶液 | 第25-26页 |
| 2.2 方法 | 第26-31页 |
| 2.2.1 实验材料的准备 | 第26页 |
| 2.2.2 总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.3 反转录反应 | 第27-28页 |
| 2.2.4 目的基因PAL的PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.5 目的基因PAL的回收纯化 | 第29页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的制备(CaCl_2-MgCl_2法) | 第29-30页 |
| 2.2.7 连接及转化 | 第30-31页 |
| 2.2.8 筛选与鉴定 | 第31页 |
| 2.2.9 生物信息学分析 | 第31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-38页 |
| 2.3.1 cDNA的获得 | 第31-32页 |
| 2.3.2 目的基因PAL的克隆 | 第32-33页 |
| 2.3.3 膜荚黄芪PAL基因ORF分析结果 | 第33-35页 |
| 2.3.4 膜荚黄芪PAL基因信号肽分析 | 第35-36页 |
| 2.3.5 膜荚黄芪PAL酶活性位点分析 | 第36-37页 |
| 2.3.6 膜荚黄芪PAL基因同源性分析 | 第37-38页 |
| 2.4 讨论 | 第38-40页 |
| 3 膜荚黄芪AmPAL基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第40-62页 |
| 3.1 材料 | 第40-43页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第40-41页 |
| 3.1.2 工具酶 | 第41页 |
| 3.1.3 培养基 | 第41-43页 |
| 3.1.4 常用溶液 | 第43页 |
| 3.2 方法 | 第43-52页 |
| 3.2.1 表达载体pPIC9K-AmPAL的构建 | 第43-46页 |
| 3.2.2 表达载体pPIC9K-PAL的鉴定 | 第46页 |
| 3.2.3 表达载体pPIC9K-PAL电转毕赤酵母GS115 | 第46-49页 |
| 3.2.4 高拷贝转化子的筛选 | 第49页 |
| 3.2.5 重组酵母GS115-pPIC9K-AmPAL的菌落PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 3.2.6 重组酵母GS115-pPIC9K-AmPAL的诱导表达 | 第50页 |
| 3.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳检测 | 第50-51页 |
| 3.2.8 PAL的纯化 | 第51页 |
| 3.2.9 Bradford法测PAL蛋白浓度 | 第51-52页 |
| 3.2.10 重组酵母表达产物PAL酶活性测定 | 第52页 |
| 3.3 结果与分析 | 第52-60页 |
| 3.3.1 表达载体pPIC9K-AmPAL的鉴定 | 第52-55页 |
| 3.3.2 表达载体pPIC9K-AmPAL的转化与筛选 | 第55-56页 |
| 3.3.3 重组酵母GS115-pPIC9K-AmPAL菌落PCR鉴定 | 第56-57页 |
| 3.3.4 蛋白PAL的诱导表达 | 第57-58页 |
| 3.3.5 蛋白PAL的纯化 | 第58-59页 |
| 3.3.6 PAL酶活分析 | 第59-60页 |
| 3.4 讨论 | 第60-62页 |
| 4 膜荚黄芪AmPAL基因在大肠杆菌中的胞内表达 | 第62-69页 |
| 4.1 材料 | 第62-63页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第62页 |
| 4.1.2 工具酶 | 第62页 |
| 4.1.3 培养基 | 第62-63页 |
| 4.2 方法 | 第63-65页 |
| 4.2.1 膜荚黄芪AmPAL基因的克隆 | 第63-64页 |
| 4.2.2 表达载体pET32a-AmPAL的构建及其鉴定 | 第64页 |
| 4.2.3 pET32a-AmPAL转化大肠杆菌BL21及其鉴定 | 第64页 |
| 4.2.4 AmPAL在大肠杆菌BL21中的诱导表达 | 第64-65页 |
| 4.2.5 PAL粗酶活测定 | 第65页 |
| 4.3 结果与分析 | 第65-67页 |
| 4.3.1 AmPAL基因的克隆 | 第65-66页 |
| 4.3.2 大肠杆菌BL21-pET-32a-AmPAL的诱导表达及活性分析 | 第66-67页 |
| 4.4 讨论 | 第67-69页 |
| 5 大豆GmPAL基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第69-75页 |
| 5.1 材料 | 第69页 |
| 5.2 方法 | 第69-70页 |
| 5.3 结果与分析 | 第70-73页 |
| 5.3.1 大豆GmPAL基因的生物信息学分析 | 第70-73页 |
| 5.3.2 重组酵母GS115-pPIC9K-GmPAL | 第73页 |
| 5.4 讨论 | 第73-75页 |
| 6 结论和展望 | 第75-77页 |
| 6.1 结论 | 第75页 |
| 6.2 展望 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 附录部分 | 第81-83页 |
| 附录1 | 第81页 |
| 附录2 | 第81-83页 |
| 附录3 | 第83页 |
