| 中文摘要 | 第1-20页 |
| 英文摘要(ABSTRACT) | 第20-25页 |
| 缩略词表 | 第25-27页 |
| 第一章 文献综述 | 第27-53页 |
| 1 干扰素的分类及性质 | 第27-30页 |
| ·Ⅰ型干扰素 | 第28页 |
| ·Ⅱ型干扰素 | 第28-29页 |
| ·Ⅲ型干扰素 | 第29-30页 |
| 2 干扰素的分子结构 | 第30页 |
| 3 干扰素的产生 | 第30-32页 |
| 4 干扰素的作用机制 | 第32-37页 |
| ·干扰素受体 | 第33-34页 |
| ·Ⅰ型干扰素受体 | 第33-34页 |
| ·Ⅱ型干扰素受体 | 第34页 |
| ·IFN-γ受体 | 第34页 |
| ·干扰素的信号传导和效应途径 | 第34-37页 |
| ·干扰素的信号传导 | 第34-35页 |
| ·IFN-α/β | 第35页 |
| ·IFN-γ | 第35页 |
| ·效应途径 | 第35-37页 |
| ·PKR途径 | 第35-36页 |
| ·2'-5'OAS途径 | 第36页 |
| ·Mx途径 | 第36-37页 |
| 5 IFN的生物学活性 | 第37-43页 |
| ·抗病毒繁殖作用 | 第37-38页 |
| ·抑制细胞分裂增殖、抗肿瘤作用 | 第38页 |
| ·免疫凋节作用 | 第38-39页 |
| ·免疫佐剂作用 | 第39页 |
| ·干扰素与机体组织系统的相互作用和影响 | 第39-43页 |
| ·干扰素信号的负调控因素 | 第39-41页 |
| ·SOCS家族 | 第40页 |
| ·PIAS家族 | 第40页 |
| ·PTP家族 | 第40-41页 |
| ·干扰素与神经内分泌系统的相互作用 | 第41页 |
| ·病毒对干扰素的抵抗 | 第41-43页 |
| ·转录水平的抑制—病毒阻抑干扰素的诱生 | 第42页 |
| ·病毒对干扰素信号通路的抑制 | 第42页 |
| ·病毒对干扰素效应蛋白的抑制 | 第42-43页 |
| 6 家禽α干扰素的研究概况 | 第43-45页 |
| 7 IFN的基因工程研究及应用 | 第45-47页 |
| ·IFN的基因工程研究 | 第45-46页 |
| ·干扰素的应用 | 第46-47页 |
| ·干扰素临床应用中的副作用问题 | 第47页 |
| 8 α干扰素作为免疫佐剂的研究进展 | 第47-49页 |
| 9 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 | 第49-53页 |
| ·分泌蛋白的翻译后修饰加工 | 第50-51页 |
| ·影响外源蛋白表达的因素 | 第51-53页 |
| 第二章 研究目的与意义 | 第53-56页 |
| 第三章 鹅INF-α基因的克隆及生物信息学分析 | 第56-92页 |
| 1 实验材料 | 第56-60页 |
| ·实验动物 | 第56页 |
| ·菌种和质粒 | 第56-57页 |
| ·主要酶和试剂 | 第57页 |
| ·试剂配制 | 第57-59页 |
| ·主要仪器设备 | 第59-60页 |
| 2 实验方法 | 第60-68页 |
| ·方法设计 | 第60页 |
| ·引物设计 | 第60页 |
| ·天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养及细胞总RNA的提取 | 第60-62页 |
| ·天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养 | 第60-61页 |
| ·细胞的诱导培养 | 第61页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第61-62页 |
| ·天府肉鹅IFN-α基因的扩增 | 第62-63页 |
| ·RT-PCR反应 | 第62页 |
| ·PCR扩增目的片段及检测 | 第62-63页 |
| ·扩增产物的纯化 | 第63页 |
| ·干扰素基因的克隆与测序 | 第63-66页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第63-64页 |
| ·PCR纯化产物与克隆载体的连接 | 第64页 |
| ·连接产物的转化 | 第64-65页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第65-66页 |
| ·质粒的提取 | 第65页 |
| ·重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的双酶切鉴定 | 第65-66页 |
| ·重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的PCR鉴定 | 第66页 |
| ·序列测定 | 第66页 |
| ·天府肉鹅干扰素α的生物信息学分析 | 第66-68页 |
| ·tf-GoIFN-α ORF基因序列分裂 | 第66页 |
| ·tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 | 第66-67页 |
| ·信号肽分析 | 第67页 |
| ·糖基化位点分析 | 第67页 |
| ·跨膜区预测 | 第67页 |
| ·磷酸化位点预测 | 第67页 |
| ·疏水性分析 | 第67-68页 |
| ·亚细胞定位预测 | 第68页 |
| ·抗原表位分析 | 第68页 |
| ·二级结构分析 | 第68页 |
| ·同源性及进化树分析 | 第68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-85页 |
| ·天府肉鹅外周血单核细胞诱导培养结果 | 第68-69页 |
| ·天府肉鹅1FN-α基因PCR扩增 | 第69页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组质粒的PCR鉴定 | 第70页 |
| ·tf-GoIFN-α基因序列 | 第70-71页 |
| ·生物信息学分析 | 第71-85页 |
| ·tf-GoIFN-αORF基因序列分析 | 第71-73页 |
| ·tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 | 第73-77页 |
| ·不同动物IFN-α基因参数的分析 | 第73-74页 |
| ·天府肉鹅IFN-α基因密码子使用频率 | 第74-77页 |
| ·信号肽分析 | 第77-78页 |
| ·糖基化位点分析 | 第78-80页 |
| ·跨膜区预测 | 第80-81页 |
| ·磷酸化位点预测 | 第81-82页 |
| ·疏水性分析 | 第82页 |
| ·抗原表位分析 | 第82-83页 |
| ·亚细胞定位预测 | 第83页 |
| ·二级结构分析 | 第83页 |
| ·同源性及进化树分析 | 第83-85页 |
| 4 讨论 | 第85-91页 |
| ·天府肉鹅IFN-α的诱导和产生 | 第85页 |
| ·RNA的提取及基因扩增 | 第85-87页 |
| ·天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析 | 第87-88页 |
| ·天府肉鹅IFN-α基因的密码子特征 | 第88-91页 |
| 5 小结 | 第91-92页 |
| 第四章 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性研究 | 第92-121页 |
| 1 实验材料 | 第92-98页 |
| ·实验动物 | 第92-93页 |
| ·菌种、质粒及毒株 | 第93页 |
| ·主要酶和试剂 | 第93-94页 |
| ·试剂配制 | 第94-97页 |
| ·主要仪器设备 | 第97-98页 |
| 2 实验方法 | 第98-109页 |
| ·天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 | 第98-101页 |
| ·引物设计 | 第98页 |
| ·成熟肽基因的扩增 | 第98页 |
| ·成熟肽基因的克隆 | 第98-99页 |
| ·pMD18-T-mGoIFN-α和pET-32a(+)质粒的提取 | 第99页 |
| ·质粒DNA的酶切和回收 | 第99页 |
| ·目的基因(mGoIFN-α)和表达载体pET-32a(+)的连接 | 第99页 |
| ·重组质粒的转化 | 第99-100页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第100-101页 |
| ·PCR鉴定 | 第100页 |
| ·酶切鉴定 | 第100页 |
| ·原核表达质粒的序列测定 | 第100-101页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第101-103页 |
| ·Rosetta感受态细胞的制备 | 第101页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第101页 |
| ·诱导表达重组蛋白的条件优化 | 第101-102页 |
| ·重组蛋白的纯化和复性 | 第102-103页 |
| ·包涵体的制备 | 第102页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第102页 |
| ·包涵体的溶解 | 第102页 |
| ·透析复性 | 第102-103页 |
| ·Ni-IMAC纯化复性 | 第103页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第103页 |
| ·高免血清的制备 | 第103-105页 |
| ·蛋白疫苗的制备 | 第103-104页 |
| ·动物免疫 | 第104页 |
| ·高免血清效价检测 | 第104页 |
| ·Western Blot检测 | 第104-105页 |
| ·重组天府肉鹅α干扰素的抗病毒活性研究 | 第105-109页 |
| ·天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 | 第105-106页 |
| ·VSV的扩增与保存 | 第105页 |
| ·原代鹅胚成纤维细胞的制备和培养 | 第105页 |
| ·VSV半数细胞感染量(TCID50)测定 | 第105-106页 |
| ·重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性的测定 | 第106页 |
| ·重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 | 第106-109页 |
| ·GPV的接种、收获与毒价测定 | 第106页 |
| ·荧光定量PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 | 第106-109页 |
| ·引物设计与合成 | 第106-107页 |
| ·标准阳性模板的制备 | 第107页 |
| ·引物合理性验证及反应条件的优化 | 第107-108页 |
| ·标准曲线制备 | 第108页 |
| ·试验样品的制备 | 第108-109页 |
| ·试验分组 | 第108-109页 |
| ·样品制备 | 第109页 |
| ·定量PCR检测 | 第109页 |
| ·结果计算 | 第109页 |
| 3 结果与分析 | 第109-117页 |
| ·天府肉鹅IFN-α成熟蛋白基因片段的克隆 | 第109-110页 |
| ·天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 | 第110-111页 |
| ·重组蛋白的原核表达 | 第111-113页 |
| ·诱导时间的优化 | 第111-112页 |
| ·IPTG诱导浓度的优化 | 第112页 |
| ·天府肉鹅IFN-α成熟肽基因重组蛋白复性 | 第112-113页 |
| ·高免血清效价测定 | 第113页 |
| ·免疫兔血清的Western Blot检测 | 第113-114页 |
| ·重组天府肉鹅α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 | 第114-117页 |
| ·重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 | 第114页 |
| ·SYBR Green real-time PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 | 第114-117页 |
| ·反应条件的优化 | 第114-115页 |
| ·标准曲线的建立 | 第115页 |
| ·溶解曲线分析 | 第115-116页 |
| ·SYBR Green real-time PCR检测鹅IFN-α抗GPV活性 | 第116-117页 |
| 4 讨论 | 第117-120页 |
| ·关于信号肽及成熟蛋白基因表达 | 第117页 |
| ·关于蛋白的复性 | 第117-118页 |
| ·鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性 | 第118-119页 |
| ·SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性 | 第119-120页 |
| 5 小结 | 第120-121页 |
| 第五章 鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 | 第121-132页 |
| 1 实验材料 | 第121-122页 |
| ·实验动物\毒株 | 第121页 |
| ·主要酶和试剂 | 第121页 |
| ·试剂配制 | 第121页 |
| ·主要仪器设备 | 第121-122页 |
| 2 实验方法 | 第122-127页 |
| ·兔抗鹅IFN-α基因蛋白多克隆抗体的制备 | 第122-125页 |
| ·实验动物准备 | 第122页 |
| ·鹅卵黄IgG的提纯 | 第122页 |
| ·鹅卵黄IgG的鉴定 | 第122页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第122-123页 |
| ·蛋白疫苗的制备 | 第123页 |
| ·动物免疫 | 第123-124页 |
| ·血清的分离 | 第124页 |
| ·兔抗鹅IgG效价的测定 | 第124页 |
| ·兔血清IgG的纯化 | 第124-125页 |
| ·用辛酸-硫酸铵法粗提血清IgG | 第124-125页 |
| ·DEAEA-50纤维柱层析纯化兔抗鹅血清IgG | 第125页 |
| ·纤维素平衡 | 第125页 |
| ·离子交换层析纯化IgG | 第125页 |
| ·兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 | 第125-127页 |
| ·兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 | 第125-126页 |
| ·ELISA抗原的制备 | 第126页 |
| ·间接ELISA操作方法 | 第126页 |
| ·抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 | 第126-127页 |
| ·酶标抗体稀释度的选择 | 第127页 |
| 3 结果与分析 | 第127-129页 |
| ·免疫扩散试验 | 第127页 |
| ·抗体纯化检测 | 第127-128页 |
| ·抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 | 第128-129页 |
| ·HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 | 第129页 |
| 4 讨论 | 第129-131页 |
| ·关于血清IgG的纯化 | 第129-130页 |
| ·关于ELISA条件的优化 | 第130页 |
| ·关于酶标二抗 | 第130-131页 |
| 5 小结 | 第131-132页 |
| 第六章 天府肉鹅IFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 | 第132-148页 |
| 1 实验材料 | 第132-136页 |
| ·实验动物 | 第132页 |
| ·菌种和质粒 | 第132-133页 |
| ·主要酶和试剂 | 第133页 |
| ·主要试剂配制 | 第133-135页 |
| ·主要仪器设备 | 第135-136页 |
| 2 实验方法 | 第136-141页 |
| ·天府肉鹅α干扰素真核表达质粒的构建 | 第136-138页 |
| ·菌种的培养 | 第136页 |
| ·pMD-18-T-GoIFN-α质粒的提取 | 第136页 |
| ·目的基因的准备 | 第136页 |
| ·pcDNA3.1(+)的线性化 | 第136页 |
| ·pcDNA3.1(+)的去磷酸化 | 第136-137页 |
| ·连接反应 | 第137页 |
| ·重组质粒的转化 | 第137页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第137-138页 |
| ·PCR鉴定 | 第137-138页 |
| ·酶切鉴定 | 第138页 |
| ·真核表达质粒的序列测定 | 第138页 |
| ·pcDNA3.1-GoIFN-α在COS-7细胞中的瞬时表达 | 第138-140页 |
| ·重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染COS-7细胞 | 第138-139页 |
| ·真核表达质粒pcDNA3.1-goIFN-α的提取 | 第138页 |
| ·COS-7细胞的准备 | 第138-139页 |
| ·COS-7细胞复苏 | 第138-139页 |
| ·转染前COS-7细胞的处理 | 第139页 |
| ·脂质体法转染COS-7细胞 | 第139页 |
| ·间接免疫荧光法检测pcDNA3.1-GoIFN-α的表达 | 第139-140页 |
| ·ELISA法鉴定目的蛋白的分泌 | 第140页 |
| ·Westem blot分析 | 第140页 |
| ·pcDNA3.1-GoIFN-α生物活性的测定 | 第140-141页 |
| 3 结果与分析 | 第141-146页 |
| ·鹅α干扰素真核表达质粒的构建 | 第141页 |
| ·GoIFN-α基因表达产物在COS-7细胞中的定位 | 第141-142页 |
| ·GoIFN-α基因表达产物在细胞上清液中的检测 | 第142-143页 |
| ·Westem-blot分析 | 第143-144页 |
| ·基因表达产物GoIFN-α抗病毒检测 | 第144-146页 |
| 4 讨论 | 第146-147页 |
| ·GoIFN-α外源蛋白在COS-7细胞中的表达 | 第146页 |
| ·抗病毒活性的检测 | 第146-147页 |
| 5 小结 | 第147-148页 |
| 第七章 天府肉鹅IFN-α真核表达质粒的免疫佐剂效应 | 第148-170页 |
| 1 实验材料 | 第148-150页 |
| ·试验动物 | 第148页 |
| ·菌种、质粒和毒株 | 第148页 |
| ·主要酶和试剂 | 第148-149页 |
| ·主要试剂配制 | 第149-150页 |
| ·主要仪器设备 | 第150页 |
| 2 实验方法 | 第150-155页 |
| ·分子佐剂和小鹅瘟VP3基因疫苗大量制备和纯化 | 第150-152页 |
| ·碱裂解法提取质粒,大量制备基因疫苗及佐剂 | 第150-151页 |
| ·聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗及佐剂质粒 | 第151-152页 |
| ·动物分组和免疫 | 第152-153页 |
| ·血样的采集和处理 | 第153页 |
| ·淋巴细胞转化试验 | 第153页 |
| ·外周血淋巴细胞的分离 | 第153页 |
| ·淋巴细胞的诱导培养 | 第153页 |
| ·检测及数据处理 | 第153页 |
| ·血清IgG的变化 | 第153-154页 |
| ·ELISA抗原的制备 | 第153-154页 |
| ·血清抗体IgG检测 | 第154页 |
| ·结果分析 | 第154页 |
| ·中和抗体水平的检测 | 第154-155页 |
| ·小鹅瘟强毒的培养 | 第154-155页 |
| ·抗体水平检测 | 第155页 |
| ·计算中和指数 | 第155页 |
| 3 结果与分析 | 第155-166页 |
| ·鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 | 第155-159页 |
| ·鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量的佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 | 第157-158页 |
| ·鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 | 第158-159页 |
| ·鹅免疫GPV-VP3基因疫苗及佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 | 第159页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化结果 | 第159-164页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量佐剂后的IgG动态变化 | 第161-162页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后的IgG动态变化 | 第162-163页 |
| ·间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化 | 第163-164页 |
| ·小鹅瘟强毒TCID_(50)的测定 | 第164-165页 |
| ·中和抗体试验检测结果 | 第165-166页 |
| 4 讨论 | 第166-169页 |
| ·关于细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 | 第166-167页 |
| ·关于IFN-α的分子免疫佐剂功能 | 第167-169页 |
| 5 小结 | 第169-170页 |
| 第八章 天府肉鹅α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究 | 第170-199页 |
| 1 实验材料 | 第170-178页 |
| ·菌种、质粒和病毒 | 第170-171页 |
| ·主要酶和试剂 | 第171页 |
| ·主要试剂配制 | 第171-177页 |
| ·主要仪器设备 | 第177-178页 |
| 2 实验方法 | 第178-188页 |
| ·天府肉鹅α干扰素成熟肽基因的克隆 | 第178-179页 |
| ·引物设计及合成 | 第178-179页 |
| ·基因扩增 | 第179页 |
| ·成熟肽基因的克隆 | 第179页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第179-181页 |
| ·pMD18-T-m2GoIFN-α和pPICZαA质粒的提取 | 第179页 |
| ·质粒DNA的酶切和回收 | 第179-180页 |
| ·目的基因(mGoIFN-α)与表达载体pPICZαA的连接 | 第180页 |
| ·连接产物的转化 | 第180页 |
| ·酵母表达载体的鉴定 | 第180-181页 |
| ·PCR鉴定 | 第180-181页 |
| ·酶切鉴定 | 第181页 |
| ·酵母表达载体的序列测定 | 第181页 |
| ·天府肉鹅IFN-α在毕赤酵母中的表达 | 第181-187页 |
| ·重组酵母的构建 | 第181-184页 |
| ·空载体pPICZαA及表达载体pPICZαA-GoIFN-α的线性化 | 第181-182页 |
| ·SacⅠ单酶切 | 第181-182页 |
| ·线性化质粒的纯化 | 第182页 |
| ·受体菌X-33感受态细胞的制备 | 第182-183页 |
| ·酵母菌的电转化 | 第183页 |
| ·电转仪参数的设置 | 第183页 |
| ·电转化操作 | 第183页 |
| ·重组鹅α干扰素基因酵母菌株的鉴定 | 第183-184页 |
| ·重组酵母基因组DNA的提取 | 第183页 |
| ·PCR鉴定 | 第183-184页 |
| ·重组酵母菌株的诱导表达 | 第184-186页 |
| ·Mut+型重组酵母菌株的初步表达 | 第184页 |
| ·高拷贝重组酵母菌株的筛选 | 第184-185页 |
| ·重组酵母菌株的表达条件的优化 | 第185-186页 |
| ·诱导表达时间的优化 | 第185页 |
| ·甲醇浓度的优化 | 第185页 |
| ·双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化 | 第185-186页 |
| ·重组酵母表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 | 第186-187页 |
| ·配制SDS-PAGE凝胶 | 第186页 |
| ·SDS-PAGE | 第186页 |
| ·表达产物的Western-blot分析 | 第186-187页 |
| ·重组天府肉鹅α干扰素抗病毒活性检测 | 第187-188页 |
| ·酵母表达产物的纯化 | 第187页 |
| ·透析袋的预先处理 | 第187页 |
| ·重组IFN-α的纯化 | 第187页 |
| ·抗病毒活性检测 | 第187-188页 |
| 3 结果与分析 | 第188-194页 |
| ·成熟肽基因的克隆 | 第188-189页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第189-190页 |
| ·酵母转化子的鉴定 | 第190-191页 |
| ·斑点法筛选高表达菌株 | 第191页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第191页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE | 第191-192页 |
| ·Western-blot检测 | 第192-193页 |
| ·重组天府肉鹅IFN-α酵母表达产物的抗病毒活性检测 | 第193-194页 |
| 4 讨论 | 第194-198页 |
| ·关于表达系统的选择 | 第194-196页 |
| ·关于毕赤酵母转化方法的选取 | 第196-197页 |
| ·关于酵母表达的糖基化 | 第197-198页 |
| ·天府肉鹅α干扰素酵母表达产物的抗病毒活性 | 第198页 |
| 5 小结 | 第198-199页 |
| 结论 | 第199-200页 |
| 参考文献 | 第200-215页 |
| 致谢 | 第215-216页 |
| 攻读博士学位期间文章完成情况 | 第216页 |
