| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-20页 |
| 1.1 前言 | 第12页 |
| 1.2 IBV的流行变异及其防控 | 第12-19页 |
| 1.2.1 IBV的分类及组成 | 第12-13页 |
| 1.2.2 IBV的复制转录机制 | 第13页 |
| 1.2.3 IBV分子遗传变异的机制 | 第13-15页 |
| 1.2.3.1 基因突变引起的IBV遗传变异 | 第14页 |
| 1.2.3.2 基因重组的引起的IBV遗传变异 | 第14-15页 |
| 1.2.4 IBV疫苗免疫的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.2.5 IBV全基因组研究现状 | 第16页 |
| 1.2.6 泛素和泛素-蛋白酶体途径 | 第16-17页 |
| 1.2.7 泛素在增强DNA疫苗免疫应答中的应用 | 第17-19页 |
| 1.3 课题研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 1985年-2012年广西IBV分子流行病学研究 | 第20-51页 |
| 2.1 材料及方法 | 第20-23页 |
| 2.1.1 毒株及其来源背景 | 第20-22页 |
| 2.1.2 试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 目的基因的引物设计 | 第22-23页 |
| 2.1.4 IB病毒的增殖及其总RNA的提取 | 第23页 |
| 2.1.5 RT-PCR扩增目的基因 | 第23页 |
| 2.1.6 目的基因的克隆及其核苷酸序列测定 | 第23页 |
| 2.1.7 目的基因序列的确定及其与参考株的比较和分析 | 第23页 |
| 2.2 结果 | 第23-47页 |
| 2.2.1 S1、N、M基因和3'UTR RT-PCR扩增结果 | 第23-25页 |
| 2.2.2 S1、N、M基因和3'UTR序列的确定及比较分析 | 第25-44页 |
| 2.2.2.1 IBV分离株S1基因序列的确定及比较分析 | 第25-30页 |
| 2.2.2.2 IBV分离株N基因序列的确定及比较分析 | 第30-34页 |
| 2.2.2.3 分离株M基因的序列测定及其变异的比对与分析 | 第34-38页 |
| 2.2.2.4 IBV毒株3'UTR核苷酸序列测定及对比分析 | 第38-44页 |
| 2.2.3 基因分型与血清分型关系的探讨 | 第44-47页 |
| 2.2.3.1 血清分型结果分析 | 第45-46页 |
| 2.2.3.2 血清分型与基因分型关系 | 第46-47页 |
| 2.3 讨论 | 第47-51页 |
| 2.3.1 IBV分离株基因序列的变异情况 | 第47-48页 |
| 2.3.2 1985-2012年IBV分离毒株之间的遗传进化关系 | 第48-49页 |
| 2.3.3 血清分型与基因分型之关系的探讨 | 第49-51页 |
| 第三章 鸡IBV广西不同时期分离株GX-C和GX-NN09032的全基因组序列测定及其生物信息学分析 | 第51-71页 |
| 3.1 材料 | 第51-54页 |
| 3.1.1 IBV分离株 | 第51-52页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第52页 |
| 3.1.3 全基因扩增引物 | 第52-54页 |
| 3.1.4 生物信息学分析所用的数据 | 第54页 |
| 3.2 方法 | 第54-56页 |
| 3.2.1 毒株的增殖 | 第54页 |
| 3.2.2 病毒RNA的提取 | 第54页 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增 | 第54页 |
| 3.2.4 基因组5'RACE和3'RACE | 第54页 |
| 3.2.5 PCR产物的鉴定及纯化 | 第54-55页 |
| 3.2.6 连接及转化 | 第55页 |
| 3.2.7 克隆的鉴定及序列测定 | 第55页 |
| 3.2.8 测序结果的拼接及分析 | 第55页 |
| 3.2.9 全基因组序列的同源性分析 | 第55页 |
| 3.2.10 全基因组序列的系统发育分析 | 第55-56页 |
| 3.2.11 结构蛋白基因的系统发育分析 | 第56页 |
| 3.2.12 基因组全序列的生物信息学分析 | 第56页 |
| 3.3 试验结果 | 第56-67页 |
| 3.3.1 GX-C和GX-NN09032全基因组序列RT-PCR扩增结果 | 第56-58页 |
| 3.3.2 GX-C和GX-NN09032全基因组序列的基因注释 | 第58-60页 |
| 3.3.3 全基因组序列的系统发育分析 | 第60-61页 |
| 3.3.4 结构蛋白基因的系统发育分析 | 第61-64页 |
| 3.3.5 序列相似性分析 | 第64-65页 |
| 3.3.6 GX-NN09032和GX-C的S、N和M蛋白二级结构及糖基化和磷酸化位点分析 | 第65-67页 |
| 3.4 讨论 | 第67-71页 |
| 3.4.1 IBV广西分离株GX-C和GX-NN09032在全基因组核苷酸序列水平上分析 | 第67-68页 |
| 3.4.2 IBV广西分离株GX-C和GX-NN09032在结构蛋白基因的系统发育分析 | 第68页 |
| 3.4.3 GX-NN09032中可能存在的重组位点及其产生的机制 | 第68-69页 |
| 3.4.4 GX-NN09032和GX-C主要抗原蛋白二级结构及糖基化和磷酸化位点分析 | 第69-71页 |
| 第四章 泛素介导鸡传染性支气管炎病毒主要抗原基因真核表达质粒的构建及其免疫应答的研究 | 第71-96页 |
| 4.1 材料 | 第72-73页 |
| 4.1.1 病毒株、细胞株、菌株和载体 | 第72页 |
| 4.1.2 主要的分子生物学试剂及试剂盒 | 第72页 |
| 4.1.3 试验动物 | 第72页 |
| 4.1.4 主要的生化试剂和血清 | 第72-73页 |
| 4.2 方法 | 第73-80页 |
| 4.2.1 构建质粒引物的设计 | 第73页 |
| 4.2.2 Ub、N和S1基因的RT-PCR扩增 | 第73-74页 |
| 4.2.3 pVAX1-Ub-linker-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1、pVAX1-N及pVAX1-N-S1的构建策略 | 第74页 |
| 4.2.4 pVAX1-Ub-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1及pVAX1-N-S1的构建过程 | 第74-76页 |
| 4.2.4.1 构建的融合基因及其相应融合蛋白二级结构的预测 | 第74页 |
| 4.2.4.2 各个目的基因的PCR及pVAX1双酶切产物的纯化与回收 | 第74-76页 |
| 4.2.4.3 重组质粒的双酶切鉴定 | 第76页 |
| 4.2.4.4 重组质粒的测序鉴定 | 第76页 |
| 4.2.5 构建重组质粒的体外表达及其产物的检测 | 第76-78页 |
| 4.2.5.1 构建重组质粒的体外转染 | 第76-77页 |
| 4.2.5.2 免疫荧光方法检测转染重组质粒的基因表达 | 第77页 |
| 4.2.5.3 RT-PCR方法检测重组质粒在Vero细胞中的表达 | 第77-78页 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 | 第78-80页 |
| 4.2.6.1 动物试验的分组和处理 | 第78页 |
| 4.2.6.2 样品的采集和处理 | 第78页 |
| 4.2.6.3 免疫雏鸡血液T淋巴细胞亚型检测 | 第78-79页 |
| 4.2.6.4 血液中抗IBVIgG抗体的ELISA检测 | 第79页 |
| 4.2.6.5 雏鸡免疫器官IL-12和IFN-ymRNA表达的检测 | 第79-80页 |
| 4.2.6.6 IBV攻击雏鸡后感染率及保护率 | 第80页 |
| 4.2.7 数据处理与分析 | 第80页 |
| 4.3 试验结果 | 第80-92页 |
| 4.3.1 Ub基因和IBVN及S1基因PCR扩增结果 | 第80-81页 |
| 4.3.2 重组质粒的构建与鉴定 | 第81-85页 |
| 4.3.2.1 融合基因表达蛋白特性的软件预测结果及分析 | 第81-83页 |
| 4.3.2.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 | 第83-84页 |
| 4.3.2.3 重组质粒的测序鉴定 | 第84-85页 |
| 4.3.3 融合基因真核表达质粒体外转染及其检测 | 第85-87页 |
| 4.3.3.1 RT-PCR方法检测融合基因的mRNA表达 | 第85-86页 |
| 4.3.3.2 间接免疫荧光方法检测目的基因的蛋白表达 | 第86-87页 |
| 4.3.4 动物免疫保护试验结果 | 第87-92页 |
| 4.3.4.1 雏鸡免疫器官IL-12和IFN-γmRNA表达水平 | 第87-89页 |
| 4.3.4.2 雏鸡血液CD4~+和CD8~+T淋巴细胞动态变化 | 第89-91页 |
| 4.3.4.3 IBV IgG抗体在雏鸡外周血液中的动态变化 | 第91页 |
| 4.3.4.4 IBV攻毒试验雏鸡后免疫保护的观察结果 | 第91页 |
| 4.3.4.5 临床保护率的计算结果及IB病毒含量的比较 | 第91-92页 |
| 4.4 讨论 | 第92-96页 |
| 4.4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计及其构建策略 | 第92-93页 |
| 4.4.2 雏鸡血液CD4~+和CD8~+T淋巴细胞动态的变化及分析 | 第93页 |
| 4.4.3 雏鸡脾脏中IL-12和IFN-γmRNA表达水平的变化及分析 | 第93-94页 |
| 4.4.4 雏鸡外周血液抗IBVIgG抗体含量动态变化结果及其分析 | 第94页 |
| 4.4.5 感染率及保护率计算结果的讨论与分析 | 第94-95页 |
| 4.4.6 不同免疫组免疫保护效果的比较分析 | 第95-96页 |
| 第五章 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-107页 |
| 附录 | 第107-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 攻读博士学位期间参与研究的课题 | 第112页 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 | 第112-113页 |
