| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 绪论 | 第11-24页 |
| 1.1 杆状病毒与杆状病毒表达载体系统 | 第11-14页 |
| 1.1.1 杆状病毒的生物学特性 | 第11-12页 |
| 1.1.2 杆状病毒表达载体系统 | 第12-14页 |
| 1.2 杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中的表达 | 第14-20页 |
| 1.2.1 杆状病毒可转导的细胞 | 第14-15页 |
| 1.2.2 杆状病毒进入哺乳动物细胞的机制 | 第15页 |
| 1.2.3 杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的影响因素 | 第15-20页 |
| 1.3 重叠延伸PCR 的原理及应用 | 第20-22页 |
| 1.4 本研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 1.5 实验技术路线 | 第23-24页 |
| 第2章 材料与方法 | 第24-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-34页 |
| 2.1.1 供试材料 | 第24页 |
| 2.1.2 供试菌株和质粒 | 第24-27页 |
| 2.1.3 扩增引物 | 第27-29页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.1.5 主要分子生物学及生化试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.6 主要缓冲液、试剂及培养基的配制 | 第31-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-56页 |
| 2.2.1 重组中间质粒pFB/LM-PH 的构建 | 第34-42页 |
| 2.2.2 重组转移载体pLM 的构建 | 第42-46页 |
| 2.2.3 重组转移载体pLM-ITRs 的构建 | 第46-48页 |
| 2.2.4 重组转移质粒pLM-eGFP 与pLM-ITRs-eGFP（下称pLM-X）的构建 | 第48-49页 |
| 2.2.5 重组杆状病毒穿梭质粒Bac-LM-eGFP 与 Bac-LM-ITRs-eGFP（下称Bac-LM-X）的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.6 重组杆状病毒BV-LM-eGFP 与BV-LM-ITRs-eGFP（下称BV-LM-X)的制备与滴度测定 | 第50-52页 |
| 2.2.7 重组杆状病毒BV-LM-X 的扩增 | 第52页 |
| 2.2.8 重组杆状病毒BV-LM-X 的滴度测定 | 第52-53页 |
| 2.2.9 重组杆状病毒BV-LM-X 介导报告基因eGFP 在鸡原代细胞中的表达 | 第53-54页 |
| 2.2.10 eGFP 的检测与分析 | 第54-56页 |
| 第3章 结果与分析 | 第56-78页 |
| 3.1 重组中间质粒pFB/LM-PH 的构建 | 第56-60页 |
| 3.1.1 片段gp645P、eGFP、TM/CTD 的PCR 扩增 | 第56页 |
| 3.1.2 片段gp645P、eGFP 与TM/CTD 的融合 | 第56-57页 |
| 3.1.3 融合产物soe1 的PCR 鉴定 | 第57页 |
| 3.1.4 重组子pT-soe1 的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.1.5 片段PH-soe1 的获得 | 第58-59页 |
| 3.1.6 重组子pT-PH-soe1 的鉴定 | 第59页 |
| 3.1.7 带有粘性末端的载体pFastBac[PH]（Xba I/Hind II)和片段 PH-soe1（Xba I/Hind II）的制备 | 第59-60页 |
| 3.1.8 重组中间质粒pFB/LM-PH 的鉴定 | 第60页 |
| 3.2 重组转移载体pLM 与pLM-ITRs 的构建 | 第60-69页 |
| 3.2.1 片段CMV、WPRE 和pA 的PCR 扩增 | 第60-61页 |
| 3.2.2 重组子pT-CMV 的鉴定 | 第61页 |
| 3.2.3 片段WPRE 与pA 的融合 | 第61-62页 |
| 3.2.4 重组子pT-soe2 的鉴定 | 第62页 |
| 3.2.5 带有粘性末端的质粒pFB/SD-PH(Xba I/EcoR I)和片段 CMV(Xba I/EcoR I）的制备 | 第62-63页 |
| 3.2.6 重组中间质粒pFB/SD-PH-CMV 的鉴定 | 第63页 |
| 3.2.7 带有粘性末端的质粒pFB/SD-PH-CMV(Rsr II/EcoR I)和片段 soe2（Rsr II/EcoR I）的制备 | 第63-64页 |
| 3.2.8 重组转移载体pLM 的鉴定 | 第64页 |
| 3.2.9 重组转移载体pLM 酶切图谱的绘制 | 第64-65页 |
| 3.2.10 片段ITR-L 和ITR-R 的PCR 扩增 | 第65-66页 |
| 3.2.11 带有粘性末端的载体pLM（Xba I）和片段ITR-L（Xba I）的制备 | 第66页 |
| 3.2.12 菌液PCR 法筛选含有pLM-ITR-L 的阳性菌液 | 第66-67页 |
| 3.2.13 重组中间质粒pLM-ITR-L 的鉴定 | 第67页 |
| 3.2.14 带有粘性末端的载体pLM-ITR-L（Rsr II）和片段ITR-R（Rsr II)的制备 | 第67-68页 |
| 3.2.15 菌液PCR 法筛选含有pLM-ITRs 的阳性菌液 | 第68页 |
| 3.2.16 重组转移载体pLM-ITRs 的鉴定 | 第68-69页 |
| 3.3 重组转移质粒pLM-eGFP 与pLM-ITRs-eGFP 的构建 | 第69-71页 |
| 3.3.1 带有粘性末端的载体pLM（Sal I/EcoR I)、pLM-ITRs(Sal I/EcoR I)和片段eGFP（Sal I/EcoR I）的制备 | 第69-70页 |
| 3.3.2 菌液PCR 法筛选含有pLM-eGFP、pLM-ITRs-eGFP 的阳性菌液 | 第70页 |
| 3.3.3 重组转移质粒pLM-eGFP 与pLM-ITRs-eGFP 的鉴定 | 第70-71页 |
| 3.4 重组杆状病毒穿梭载体Bac-LM-eGFP 与Bac-LM-ITRs-eGFP 的构建 | 第71-72页 |
| 3.5 重组杆状病毒BV-LM-eGFP 与BV-LM-ITRs-eGFP 的制备与滴度测定 | 第72-73页 |
| 3.5.1 Sf9 昆虫细胞的形态变化 | 第72-73页 |
| 3.5.2 重组杆状病毒的PCR 鉴定 | 第73页 |
| 3.5.3 重组杆状病毒的滴毒测定 | 第73页 |
| 3.6 重组杆状病毒BV-LM-eGFP 与BV-LM-ITRs-eGFP 介导报告基因eGFP 在鸡原代细胞中的表达 | 第73-74页 |
| 3.7 eGFP 表达的数字图像分析 | 第74-78页 |
| 3.7.1 VSVGED 病毒假型化对重组杆状病毒转导效率的影响 | 第75-76页 |
| 3.7.2 WPRE 与 ITRs 对 eGFP 表达强度的影响 | 第76-78页 |
| 第4章 讨论 | 第78-82页 |
| 4.1 融合 PCR 法易造成碱基缺失突变 | 第78页 |
| 4.2 重组 Bacmid 的鉴定方法 | 第78-79页 |
| 4.3 VSV-GED 对重组杆状病毒转导效率的影响 | 第79-80页 |
| 4.4 WPRE 及 ITRs 对重组杆状病毒介导的 eGFP 表达强度的影响 | 第80-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第94页 |
