| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9页 |
| 缩略语表 | 第10-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-29页 |
| 1.1 链霉菌简介 | 第13-15页 |
| 1.1.1 链霉菌是工业微生物中最有应用价值的类群之一 | 第13-14页 |
| 1.1.2 链霉菌的基因组特征 | 第14-15页 |
| 1.2 链霉菌基因转移方法 | 第15-17页 |
| 1.2.1 PEG-介导的质粒转化原生质体 | 第15-16页 |
| 1.2.2 电穿孔 | 第16页 |
| 1.2.3 噬菌体转导 | 第16页 |
| 1.2.4 接合转移 | 第16-17页 |
| 1.3 免疫抑制剂研究进展 | 第17-19页 |
| 1.3.1 有机化合物 | 第17页 |
| 1.3.2 微生物酵解产物 | 第17-18页 |
| 1.3.3 抗体类免疫抑制剂 | 第18-19页 |
| 1.3.4 中药类药物 | 第19页 |
| 1.3.5 新型免疫抑制剂 | 第19页 |
| 1.4 吸水链霉菌及雷帕霉素 | 第19-25页 |
| 1.4.1 雷帕霉素产生菌简介 | 第19-20页 |
| 1.4.2 雷帕霉素研究进展 | 第20-21页 |
| 1.4.3 雷帕霉素免疫抑制作用机制的简介 | 第21-22页 |
| 1.4.4 雷帕霉素合成基因簇 | 第22-25页 |
| 1.5 微生物育种技术 | 第25-26页 |
| 1.6 利用λ-Red重组系统构建链霉菌基因置换载体 | 第26-27页 |
| 1.7 本论文的工作基础、目的及意义 | 第27-29页 |
| 2 材料与方法 | 第29-43页 |
| 2.1 材料 | 第29-34页 |
| 2.1.1 菌株 | 第29页 |
| 2.1.2 质粒 | 第29-30页 |
| 2.1.3 引物 | 第30-31页 |
| 2.1.4 培养基和生化试剂 | 第31-33页 |
| 2.1.5 抗生素的使用浓度 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-43页 |
| 2.2.1 链霉菌培养及菌种保藏(Hopwood et al.，1985) | 第34页 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取(Kieser et al.，1984) | 第34-35页 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测(Kieser et al.，1984) | 第35页 |
| 2.2.4 链霉菌总DNA的提取(Kieser et al.，2000) | 第35-36页 |
| 2.2.5 氯化锂纯化DNA(Sambrook et al.，2001) | 第36页 |
| 2.2.6 酶连反应(Sambrook et al.，1989) | 第36页 |
| 2.2.7 大肠杆菌和链霉菌的两亲本属间接合转移(Kieser et al.，2000) | 第36-37页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)及转化(Sambrook et al.，1989) | 第37页 |
| 2.2.9 DNA片段凝胶回收(试剂盒回收) | 第37-38页 |
| 2.2.10 AT克隆 | 第38-39页 |
| 2.2.11 IPTG诱导的大肠杆菌中重组基因的表达(Studier et al.，1986) | 第39页 |
| 2.2.12 PCR及相关技术 | 第39-40页 |
| 2.2.13 PCR-Targeting技术中E. coli电转化感受态的制备及电转化 | 第40-41页 |
| 2.2.14 NTG诱变链霉菌孢子(DeLic et al.，1970) | 第41-42页 |
| 2.2.14.1 方法 | 第41页 |
| 2.2.14.2 注意事项 | 第41-42页 |
| 2.2.15 抗生素最小抑菌浓度(MIC)测定 | 第42页 |
| 2.2.16 雷帕霉素的HPLC测定 | 第42-43页 |
| 2.2.16.1 仪器 | 第42页 |
| 2.2.16.2 色谱条件 | 第42页 |
| 2.2.16.3 发酵单位测定 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-69页 |
| 3.1 吸水链霉菌NRRL5491遗传操作系统的研究 | 第43-47页 |
| 3.1.1 热激温度和时间对孢子活性的影响 | 第43-44页 |
| 3.1.2 阿泊拉霉素最小抑制浓度即MIC的确定 | 第44页 |
| 3.1.3 抗生素覆盖浓度的选择 | 第44-45页 |
| 3.1.4 PCR验证结果 | 第45页 |
| 3.1.5 不同供体质粒接合转移的效率 | 第45-46页 |
| 3.1.6 培养基对接合转移的影响 | 第46-47页 |
| 3.1.7 转入质粒后对表型的影响 | 第47页 |
| 3.2 雷帕霉素生物合成基因簇标记菌株的构建 | 第47-64页 |
| 3.2.1 构建在雷帕霉素合成基因簇上ORFU上标记的菌株 | 第47-59页 |
| 3.2.1.1 雷帕霉素合成基因簇上ORFU基因及其侧翼片段的克隆 | 第47-53页 |
| 3.2.1.2 标记ORFU的基因置换载体的构建 | 第53-57页 |
| 3.2.1.3 双交换菌株的筛选 | 第57-58页 |
| 3.2.1.4 ORFU标记菌株的PCR验证 | 第58-59页 |
| 3.2.2 构建在雷帕霉素合成基因簇的结构基因rapB上标记的菌株 | 第59-64页 |
| 3.2.2.1 雷帕霉素合成基因簇上部分rapB基因及其侧翼片段的克隆 | 第59页 |
| 3.2.2.2 PCR方法克隆rapB基因及其侧翼片段 | 第59-60页 |
| 3.2.2.3 PCR产物的A-T克隆 | 第60-61页 |
| 3.2.2.4 克隆rapB基因及其侧翼序列到载体pHJL401上 | 第61-62页 |
| 3.2.2.5 标记rapB的基因置换载体的构建 | 第62-63页 |
| 3.2.2.6 双交换菌株的筛选 | 第63-64页 |
| 3.3 雷帕霉素高产菌株的选育 | 第64-69页 |
| 3.3.1 标记菌株雷帕霉素产量的检测 | 第64页 |
| 3.3.2 标记菌株对卡那霉素抗性的检测 | 第64-65页 |
| 3.3.3 筛选卡那霉素高抗性菌株 | 第65页 |
| 3.3.4 HPLC检测诱变菌株的雷帕霉素产量 | 第65-69页 |
| 4 总结与讨论 | 第69-73页 |
| 4.1 总结 | 第69-70页 |
| 4.1.1 建立雷帕霉素产生菌吸水链霉菌NRRL5491遗传操作系统 | 第69页 |
| 4.1.2 报告基因辅助的微生物高产育种体系在选育雷帕霉素高产菌株上的应用尝试 | 第69-70页 |
| 4.1.2.1 构建在雷帕霉素合成基因簇的调节基因ORFU上标记的菌株 | 第69-70页 |
| 4.1.2.2 构建在雷帕霉素合成基因簇的结构基因rapB上标记的菌株 | 第70页 |
| 4.1.2.3 选育雷帕霉素高产菌株 | 第70页 |
| 4.2 讨论 | 第70-72页 |
| 4.2.1 吸水链霉菌接合转移系统 | 第70-71页 |
| 4.2.2 新型高产育种体系在吸水链霉菌中的应用 | 第71-72页 |
| 4.3 展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
