| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 1 文献综述 | 第8-12页 |
| 1.1 α-淀粉酶概述 | 第8-9页 |
| 1.2 甲壳动物蜕皮周期及调控机理 | 第9-12页 |
| 1.2.1 蜕皮周期划分 | 第9-10页 |
| 1.2.2 蜕皮的调控机理 | 第10-12页 |
| 2 引言 | 第12-14页 |
| 2.1 研究的目的及意义 | 第12页 |
| 2.2 研究内容 | 第12-13页 |
| 2.2.1 Pc-amy原核表达及多抗制备 | 第12页 |
| 2.2.2 Pc-amy组织特异性表达分析 | 第12页 |
| 2.2.3 蜕皮激素对Pc-amy表达影响 | 第12页 |
| 2.2.4 重组Pc-Amy蛋白酶活测定 | 第12-13页 |
| 2.3 技术路线 | 第13-14页 |
| 3 材料与方法 | 第14-29页 |
| 3.1 试验材料 | 第14页 |
| 3.2 仪器与试剂 | 第14-18页 |
| 3.2.1 主要实验仪器 | 第14-15页 |
| 3.2.2 主要生化试剂 | 第15页 |
| 3.2.3 常用溶液的配制 | 第15-18页 |
| 3.3 实验方法 | 第18-29页 |
| 3.3.1 α-淀粉酶基因的克隆 | 第18-21页 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 | 第18页 |
| 3.3.1.2 RNA质量检测 | 第18-19页 |
| 3.3.1.3 cDNA合成 | 第19页 |
| 3.3.1.4 引物设计和PCR扩增 | 第19-20页 |
| 3.3.1.5 PCR产物的纯化 | 第20-21页 |
| 3.3.1.6 目的片段与pMD-19T连接和转化 | 第21页 |
| 3.3.1.7 序列分析 | 第21页 |
| 3.3.2 α-淀粉酶基因原核表达 | 第21-23页 |
| 3.3.2.1 质粒抽提 | 第21-22页 |
| 3.3.2.2 目的片段和pET-28a的双酶切 | 第22页 |
| 3.3.2.3 连接目的基因和表达载体 | 第22页 |
| 3.3.2.4 重组蛋白诱导表达 | 第22-23页 |
| 3.3.3 重组蛋白的鉴定及纯化 | 第23-25页 |
| 3.3.3.1 SDS-PAGE电泳检测 | 第23页 |
| 3.3.3.2 重组蛋白的纯化 | 第23-24页 |
| 3.3.3.3 Western blot分析 | 第24-25页 |
| 3.3.4 蛋白定量 | 第25页 |
| 3.3.5 多克隆抗体制备 | 第25-26页 |
| 3.3.5.1 免疫动物及抗血清的收集 | 第25页 |
| 3.3.5.2 ELISA测抗体效价 | 第25-26页 |
| 3.3.6 α-淀粉酶基因的组织表达特异性分析 | 第26-27页 |
| 3.3.6.1 各组织总RNA的提取 | 第26页 |
| 3.3.6.2 各组织总蛋白的抽取 | 第26页 |
| 3.3.6.3 α-淀粉酶基因荧光定量PCR分析 | 第26页 |
| 3.3.6.4 α-淀粉酶蛋白的Western blot分析 | 第26-27页 |
| 3.3.7 蜕皮激素处理对Pc-amy表达的影响 | 第27页 |
| 3.3.8 重组蛋白质复性及酶活分析 | 第27-29页 |
| 3.3.8.1 重组蛋白Pc-Amy复性 | 第27页 |
| 3.3.8.2 重组蛋白Pc-Amy酶活测定 | 第27-29页 |
| 4 结果与分析 | 第29-38页 |
| 4.1 总RNA的检测 | 第29页 |
| 4.2 Pc-amy基因的ORF序列克隆 | 第29-30页 |
| 4.3 Pc-amy序列分析 | 第30-32页 |
| 4.4 原核表达载体构建 | 第32-33页 |
| 4.5 重组蛋白His6-Amy表达与纯化 | 第33-34页 |
| 4.5.1 重组蛋白表达 | 第33页 |
| 4.5.2 重组蛋白纯化 | 第33-34页 |
| 4.6 Bradford法蛋白定量 | 第34-35页 |
| 4.7 多克隆抗体制备 | 第35页 |
| 4.8 Pc-amy组织特异性表达分析 | 第35-36页 |
| 4.9 蜕皮激素处理对Pc-amy表达的影响 | 第36-37页 |
| 4.10 重组蛋白复性及酶活分析 | 第37-38页 |
| 5 讨论 | 第38-39页 |
| 5.1 α-淀粉酶基因的序列分析 | 第38页 |
| 5.2 α-淀粉酶的原核表达 | 第38页 |
| 5.3 α-淀粉酶的组织特异性分析 | 第38页 |
| 5.4 蜕皮激素对 α-淀粉酶表达水平的影响 | 第38-39页 |
| 6 结论 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 个人简介 | 第46页 |
| 读研期间的研究成果 | 第46页 |