| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 前言 | 第11-26页 |
| 1.1 毕赤酵母分泌表达外源蛋白 | 第11-18页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统概述 | 第11-14页 |
| 1.1.2 毕赤酵母中蛋白折叠与翻译后修饰 | 第14-15页 |
| 1.1.3 毕赤酵母中的信号肽的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.1.4 毕赤酵母系统生物学进展 | 第17-18页 |
| 1.1.5 优化毕赤酵母表达系统的手段 | 第18页 |
| 1.2 7-氨基头孢烷酸(7-ACA)与头孢菌素C(CPC)酰化酶 | 第18-21页 |
| 1.2.1 7-氨基头孢烷酸(7-ACA) | 第18-19页 |
| 1.2.2 头孢菌素C酰化酶的来源与分类 | 第19-21页 |
| 1.2.3 酰化酶的3D模型 | 第21页 |
| 1.3 头孢菌素C酰化酶的进化与人工重组表达 | 第21-25页 |
| 1.3.1 对酰化酶蛋白序列的改造 | 第23-24页 |
| 1.3.2 酰化酶异源表达的发酵条件优化 | 第24-25页 |
| 1.4 课题内容及意义 | 第25-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-32页 |
| 2.1.1 质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.2 菌株 | 第27-28页 |
| 2.1.3 引物 | 第28-29页 |
| 2.1.4 常规试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.5 试剂盒与工具酶 | 第30页 |
| 2.1.6 溶液配制 | 第30-31页 |
| 2.1.7 培养基 | 第31页 |
| 2.1.8 实验仪器 | 第31-32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-39页 |
| 2.2.1 分子生物学实验方法 | 第32-36页 |
| 2.2.2 挑选单拷贝毕赤酵母转化子 | 第36页 |
| 2.2.3 毕赤酵母摇瓶发酵培养 | 第36页 |
| 2.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第36-37页 |
| 2.2.5 绿色荧光蛋白(EGFP)荧光强度测定 | 第37页 |
| 2.2.6 β-半乳糖苷酶酶活测定 | 第37页 |
| 2.2.7 CPC酰化酶酶活测定 | 第37-39页 |
| 第3章 毕赤酵母内源信号肽的筛选 | 第39-56页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 毕赤酵母内源信号肽序列的筛选 | 第39-41页 |
| 3.3 候选信号肽对绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌效果 | 第41-48页 |
| 3.3.1 EGFP分泌表达质粒及重组表达菌的构建 | 第41-44页 |
| 3.3.2 摇瓶培养条件优化 | 第44-46页 |
| 3.3.3 内源信号肽对EGFP分泌表达效果的影响 | 第46-48页 |
| 3.4 内源信号肽对β-半乳糖苷酶(β-gal)的分泌效果 | 第48-53页 |
| 3.4.1 β-gal分泌表达质粒及重组菌的构建 | 第48-51页 |
| 3.4.2 摇瓶培养条件优化 | 第51-52页 |
| 3.4.3 不同信号肽对β-gal分泌表达效果的影响 | 第52-53页 |
| 3.5 讨论 | 第53-54页 |
| 3.6 本章小结 | 第54-56页 |
| 第4章 CPC酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达 | 第56-66页 |
| 4.1 引言 | 第56页 |
| 4.2 CPC酰化酶基因序列的分析与优化 | 第56-57页 |
| 4.2.1 CPC酰化酶序列的分析与选择 | 第56页 |
| 4.2.2 SECA基因序列的优化 | 第56-57页 |
| 4.3 SECA分泌表达载体及重组毕赤酵母的构建 | 第57-60页 |
| 4.3.1 SECA分泌表达载体的构建 | 第57-60页 |
| 4.3.2 SECA分泌表达菌株构建 | 第60页 |
| 4.4 内源信号肽介导CPC酰化酶的分泌表达 | 第60-63页 |
| 4.4.1 培养基对SECA分泌表达的影响 | 第60-61页 |
| 4.4.2 不同信号肽介导SECA的胞内外表达 | 第61-62页 |
| 4.4.3 不同信号肽引导SECA基因的mRNA二级结构分析 | 第62-63页 |
| 4.5 高拷贝菌株的筛选 | 第63-64页 |
| 4.6 讨论 | 第64-65页 |
| 4.7 本章小结 | 第65-66页 |
| 第5章 结论与展望 | 第66-68页 |
| 5.1 结论 | 第66-67页 |
| 5.2 展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
