| 摘要 | 第4-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 1 引言 | 第14-44页 |
| 1.1 链霉菌抗生素调控机制研究及提高抗生素产量的策略 | 第15-34页 |
| 1.1.1 链霉菌抗生素调控机制 | 第15-27页 |
| 1.1.2 提高链霉菌合成抗生素产量的策略 | 第27-34页 |
| 1.2 龟裂链霉菌土霉素生物合成机制的研究 | 第34-38页 |
| 1.2.1 土霉素生产菌——龟裂链霉菌 | 第34-35页 |
| 1.2.2 龟裂链霉菌土霉素生物合成机制 | 第35-38页 |
| 1.3 基因工程改造龟裂链霉菌提高土霉素产量的具体实例 | 第38-40页 |
| 1.3.1 敲除竞争途径提高土霉素合成所需前体 | 第38页 |
| 1.3.2 过表达土霉素合成聚酮合酶模块 | 第38-39页 |
| 1.3.3 增强土霉素分子的外排机制 | 第39页 |
| 1.3.4 增强土霉素途径特异性调控蛋白OtcR表达 | 第39页 |
| 1.3.5 过表达乙酰辅酶A羧化酶增加胞内丙二酸单酰辅酶A含量 | 第39-40页 |
| 1.4 国内外土霉素市场的应用及需求分析 | 第40页 |
| 1.5 本文研究内容、技术路线和研究意义 | 第40-44页 |
| 1.5.1 研究内容 | 第40-41页 |
| 1.5.2 技术路线 | 第41-42页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第42-44页 |
| 2 土霉素合成途径特异性激活子OTCR鉴定和功能分析 | 第44-80页 |
| 2.1 材料与方法 | 第44-62页 |
| 2.1.1 材料 | 第44-53页 |
| 2.1.1.1 菌株与质粒 | 第44-47页 |
| 2.1.1.2 引物序列 | 第47-49页 |
| 2.1.1.3 培养基 | 第49-51页 |
| 2.1.1.4 常用缓冲液 | 第51-52页 |
| 2.1.1.5 抗生素 | 第52页 |
| 2.1.1.6 主要化学试剂及酶 | 第52-53页 |
| 2.1.1.7 实验仪器 | 第53页 |
| 2.1.2 方法 | 第53-62页 |
| 2.1.2.1 链霉菌基因组DNA提取方法 | 第53-54页 |
| 2.1.2.2 大肠杆菌质粒提取方法 | 第54页 |
| 2.1.2.3 琼脂糖凝胶DNA回收方法 | 第54页 |
| 2.1.2.4 链霉菌RNA提取方法 | 第54-55页 |
| 2.1.2.5 Real-time qPCR及半定量PCR | 第55-57页 |
| 2.1.2.6 克隆载体组装方法 | 第57页 |
| 2.1.2.7 大肠杆菌感受态制备及DNA载体的转化 | 第57-58页 |
| 2.1.2.8 链霉菌与大肠杆菌接合转移操作流程 | 第58页 |
| 2.1.2.9 生物量测定方法 | 第58-59页 |
| 2.1.2.10 基因组文库构建 | 第59页 |
| 2.1.2.11 途径特异性调控蛋白OtcR氨基酸序列分析 | 第59页 |
| 2.1.2.12 途径特异性调控基因otcR敲除及回补载体构建 | 第59-60页 |
| 2.1.2.13 OtcR敲除突变株发酵及土霉素检测方法 | 第60页 |
| 2.1.2.14 绿色荧光蛋白表征OtcR调控作用的载体及其突变株构建 | 第60-61页 |
| 2.1.2.15 RT-PCR检测OtcR对土霉素合成基因簇转录的影响 | 第61-62页 |
| 2.2 结果与分析 | 第62-77页 |
| 2.2.1 生物信息学分析预测OtcR蛋白结构特征 | 第62-65页 |
| 2.2.2 途径特异性调控基因otcR功能验证 | 第65-68页 |
| 2.2.3 绿色荧光蛋白表征OtcR对土霉素合成基因簇的激活作用 | 第68-71页 |
| 2.2.4 RT-qPCR验证OtcR促进土霉素合成基因簇转录 | 第71-77页 |
| 2.3 讨论 | 第77-78页 |
| 2.4 小结 | 第78-80页 |
| 3 基因工程改造龟裂链霉菌M4018提高其土霉素产量 | 第80-98页 |
| 3.1 材料与方法 | 第80-88页 |
| 3.1.1 材料 | 第80-82页 |
| 3.1.1.1 菌株与质粒 | 第80-81页 |
| 3.1.1.2 引物序列 | 第81-82页 |
| 3.1.2 方法 | 第82-88页 |
| 3.1.2.1 质粒构建 | 第82-84页 |
| 3.1.2.2 突变株构建 | 第84页 |
| 3.1.2.3 化学显色法测定土霉素含量 | 第84-85页 |
| 3.1.2.4 LC-MS技术测定胞内丙二酸单酰辅酶A | 第85-86页 |
| 3.1.2.5 DNS法测定还原糖 | 第86-87页 |
| 3.1.2.6 纳氏法测定氮含量 | 第87-88页 |
| 3.2 结果与分析 | 第88-96页 |
| 3.2.1 过表达OtcR促进龟裂链霉菌合成土霉素产量 | 第88-90页 |
| 3.2.2 启动子改造及过表达otcR促进土霉素产量提高 | 第90-92页 |
| 3.2.3 绿色荧光蛋白表征启动子的活性 | 第92-93页 |
| 3.2.4 过表达乙酰辅酶A羧化酶提高龟裂链霉菌合成土霉素产量 | 第93-94页 |
| 3.2.5 高产土霉素工程菌株的构建策略 | 第94-95页 |
| 3.2.6 高产土霉素工程菌增强碳源和氮源的利用 | 第95-96页 |
| 3.3 讨论 | 第96-97页 |
| 3.4 小结 | 第97-98页 |
| 4 土霉素合成基因簇异源表达 | 第98-116页 |
| 4.1 材料与方法 | 第98-103页 |
| 4.1.1 材料 | 第98-101页 |
| 4.1.1.1 菌株和质粒 | 第98-100页 |
| 4.1.1.2 引物序列 | 第100-101页 |
| 4.1.2 方法 | 第101-103页 |
| 4.1.2.1 Red-ET技术重组获得土霉素合成基因簇 | 第101页 |
| 4.1.2.2 PCR-targeting技术敲除负调控基因otrR | 第101-102页 |
| 4.1.2.3 质粒构建 | 第102页 |
| 4.1.2.4 异源宿主生长曲线及对土霉素耐受性分析 | 第102页 |
| 4.1.2.5 RT-PCR | 第102页 |
| 4.1.2.6 丙二酸单酰辅酶A定量分析 | 第102-103页 |
| 4.1.2.7 土霉素异源表达工程菌株发酵及HPLC分析土霉素合成 | 第103页 |
| 4.2 结果与分析 | 第103-112页 |
| 4.2.1 异源表达宿主生长速率及对土霉素耐受性评价比较 | 第103-104页 |
| 4.2.2 土霉素合成基因簇的克隆及异源表达 | 第104-107页 |
| 4.2.3 增强正调控基因表达和敲除负调控基因提高土霉素产量 | 第107-109页 |
| 4.2.4 过表达乙酰辅酶A羧化酶提高异源宿主合成土霉素的产量 | 第109-112页 |
| 4.3 讨论 | 第112-113页 |
| 4.4 小结 | 第113-116页 |
| 5 结论与展望 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-130页 |
| 致谢 | 第130-132页 |
| 作者简介 | 第132页 |
