| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 文献综述 | 第13-27页 |
| 第一章 人工内切酶介导的基因打靶研究进展 | 第13-24页 |
| 1.1 可编程人工核酸内切酶的共有特性 | 第14-15页 |
| 1.1.1 快速DSB切口的生成 | 第14页 |
| 1.1.2 基因的敲除 | 第14页 |
| 1.1.3 基因的插入 | 第14-15页 |
| 1.1.4 基因的修正和点突变 | 第15页 |
| 1.1.5 染色体的重排 | 第15页 |
| 1.2 ZFNs相关背景 | 第15-17页 |
| 1.2.1 ZFNs的构成 | 第16-17页 |
| 1.2.2 ZFNs的设计实现 | 第17页 |
| 1.2.3 ZFNs的可打靶位点 | 第17页 |
| 1.3 RNA介导的人工核酸内切酶 | 第17-19页 |
| 1.3.1 RGENs的构成 | 第17-19页 |
| 1.3.2 RGENs的设计实现 | 第19页 |
| 1.3.3 RGENs的可打靶位点 | 第19页 |
| 1.4 可编程人工核酸内切酶的选用原则 | 第19-22页 |
| 1.4.1 人工核酸内切酶的成功率和活性 | 第20页 |
| 1.4.2 人工核酸内切酶的位点特异性 | 第20-21页 |
| 1.4.3 人工核酸内切酶实现多路基因编辑 | 第21页 |
| 1.4.4 人工核酸内切酶的突变特征 | 第21页 |
| 1.4.5 人工核酸内切酶的传递途径 | 第21-22页 |
| 1.5 基因打靶的应用进展 | 第22-24页 |
| 1.5.1 临床研究进展 | 第22页 |
| 1.5.2 生物技术领域研究进展 | 第22-23页 |
| 1.5.3 医疗领域研究进展 | 第23-24页 |
| 第二章 乳铁蛋白基因研究进展 | 第24-27页 |
| 2.1 Lf的背景简介 | 第24-25页 |
| 2.2 Lf的应用前景 | 第25-27页 |
| 实验部分 | 第27-60页 |
| 第三章 基因打靶系统所需载体的构建 | 第27-43页 |
| 3.1 实验材料 | 第28-29页 |
| 3.1.1 试剂和仪器 | 第28页 |
| 3.1.2 溶液配制 | 第28-29页 |
| 3.2 实验方法 | 第29-36页 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9打靶系统的构建及活性分析 | 第29-35页 |
| 3.2.2 ZFNs表达载体的获取及鉴定 | 第35页 |
| 3.2.3 基因打靶载体的构建 | 第35-36页 |
| 3.3 实验结果 | 第36-41页 |
| 3.3.1 Cas9蛋白真核表达载体pCas9-C1的构建结果 | 第36-37页 |
| 3.3.2 gRNA表达载体pSilence-gRNA的构建结果 | 第37-38页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9打靶系统剪切效率鉴定结果 | 第38-40页 |
| 3.3.4 ZFNs表达载体鉴定结果 | 第40页 |
| 3.3.5 基因打靶载体的构建结果 | 第40-41页 |
| 3.4 讨论 | 第41-42页 |
| 3.5 小结 | 第42-43页 |
| 第四章 牛胎儿成纤维细胞转染和阳性克隆筛选 | 第43-56页 |
| 4.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 4.1.1 试剂和仪器 | 第43页 |
| 4.1.2 溶液配制 | 第43-44页 |
| 4.2 实验方法 | 第44-49页 |
| 4.2.1 制备所需去内毒素转染质粒 | 第44-45页 |
| 4.2.2 牛胎儿成纤维细胞准备 | 第45页 |
| 4.2.3 细胞转染及阳性克隆筛选 | 第45页 |
| 4.2.4 细胞单克隆的PCR鉴定 | 第45-47页 |
| 4.2.5 CMV启动子甲基化水平检测 | 第47-49页 |
| 4.3 实验结果 | 第49-53页 |
| 4.3.1 CRISPR/Cas9打靶系统诱导hLf基因定点插入牛胎儿成纤维细胞CSN2位点结果 | 第49-51页 |
| 4.3.2 ZFNs诱导hLf基因定点插入牛胎儿成纤维细胞CSN2位点结果 | 第51-52页 |
| 4.3.3 CMV启动子甲基化水平检测结果 | 第52-53页 |
| 4.4 讨论 | 第53-55页 |
| 4.5 小结 | 第55-56页 |
| 第五章 核移植转基因胚胎的获得 | 第56-60页 |
| 5.1 实验材料 | 第56页 |
| 5.1.1 试剂和仪器 | 第56页 |
| 5.1.2 溶液配制 | 第56页 |
| 5.2 实验方法 | 第56-57页 |
| 5.2.1 卵母细胞的采集、体外成熟 | 第56-57页 |
| 5.2.2 供体细胞的准备 | 第57页 |
| 5.2.3 体细胞核移植、转基因克隆胚的获得 | 第57页 |
| 5.2.4 转基因克隆胚的PCR检测 | 第57页 |
| 5.3 实验结果 | 第57-58页 |
| 5.4 讨论 | 第58-59页 |
| 5.5 小结 | 第59-60页 |
| 全文总结 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-72页 |
| 附录 | 第72-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 作者简介 | 第77页 |
