| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第10-17页 |
| 第1章 前言 | 第17-55页 |
| 1.1 p73基因简介 | 第17-26页 |
| 1.1.1 p73的定位、结构和修饰 | 第17-19页 |
| 1.1.2 p73的功能 | 第19-23页 |
| 1.1.3 p73异构体的结构与功能 | 第23-26页 |
| 1.2 p53异构体的结构与功能 | 第26-32页 |
| 1.2.1 p53异构体的结构 | 第26-28页 |
| 1.2.2 p53异构体的功能 | 第28-32页 |
| 1.3 DNA损伤与修复信号通路 | 第32-44页 |
| 1.3.1 DNA损伤类型和DNA修复类型简介 | 第32-33页 |
| 1.3.2 NER、BER和MMR修复通路 | 第33-37页 |
| 1.3.3 DNA双链断裂修复通路 | 第37-41页 |
| 1.3.4 p53蛋白家族与DNA损伤修复通路 | 第41-44页 |
| 1.4 模式生物斑马鱼简介 | 第44-48页 |
| 1.4.1 斑马鱼研究历史 | 第44-45页 |
| 1.4.2 斑马鱼作为模式动物的研究优势 | 第45-47页 |
| 1.4.3 斑马鱼研究应用概述 | 第47-48页 |
| 1.5 基因编辑技术 | 第48-53页 |
| 1.5.1 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9技术简介及其应用 | 第48-51页 |
| 1.5.2 现有编辑技术的总结与比较 | 第51-53页 |
| 1.6 本课题研究的背景意义 | 第53-55页 |
| 第2章 实验材料和方法 | 第55-87页 |
| 2.1 斑马鱼体系及相关实验操作 | 第55-56页 |
| 2.1.1 斑马鱼品系及其饲养 | 第55页 |
| 2.1.2 斑马鱼受精卵的获取 | 第55页 |
| 2.1.3 斑马鱼受精卵显微注射 | 第55-56页 |
| 2.2 人类细胞系及其相关实验操作 | 第56-58页 |
| 2.2.1 实验中用到的细胞系及其培养 | 第56-57页 |
| 2.2.2 细胞冻存与细胞复苏 | 第57页 |
| 2.2.3 细胞瞬时转染 | 第57-58页 |
| 2.2.4 细胞集落生成实验(CCA) | 第58页 |
| 2.2.5 细胞衰老检测 | 第58页 |
| 2.3 DNA相关实验方法 | 第58-64页 |
| 2.3.1 常规分子克隆相关实验方法 | 第58-62页 |
| 2.3.2 定点突变克隆和删除小片段克隆的相关实验方法 | 第62页 |
| 2.3.3 无缝克隆 | 第62-63页 |
| 2.3.4 斑马鱼胚胎基因组DNA简单提取 | 第63页 |
| 2.3.5 斑马鱼以及人细胞系DNA提取 | 第63页 |
| 2.3.6 Commet assay检测DNA损伤积累 | 第63-64页 |
| 2.4 RNA相关实验方法 | 第64-66页 |
| 2.4.1 总RNA提取 | 第64页 |
| 2.4.2 DNasel处理总RNA以及纯化 | 第64-65页 |
| 2.4.3 逆转录(reverse transcription) | 第65页 |
| 2.4.4 mRNA的体外合成 | 第65-66页 |
| 2.4.5 northern blot | 第66页 |
| 2.6 蛋白相关实验方法 | 第66-70页 |
| 2.6.1 总蛋白提取 | 第66-67页 |
| 2.6.2 蛋白印迹杂交 | 第67-68页 |
| 2.6.3 蛋白免疫荧光实验 | 第68页 |
| 2.6.4 蛋白体外互作实验与体内互作实验 | 第68-69页 |
| 2.6.5 CHIP-assay | 第69-70页 |
| 2.7 CRISPR/Cas9技术(Alcian blue staining) | 第70-72页 |
| 2.7.1 gRNA的设计及gRNA合成模板的扩增纯化 | 第70页 |
| 2.7.2 cas9 mRNA的合成及gRNA的合成 | 第70-71页 |
| 2.7.3 cas9 mRNA和gRNA的显微共注射 | 第71页 |
| 2.7.4 F0代突变效率的检测与检测 | 第71页 |
| 2.7.5 F1代突变体的筛选与鉴定 | 第71-72页 |
| 2.8 常用溶液及培养基 | 第72-73页 |
| 2.9 本课题中所用到的抗体、SiRNA以及引物的序列 | 第73-87页 |
| 2.9.1 实验中所用抗体列表 | 第73-74页 |
| 2.9.2 实验中所用SiRNA序列列表 | 第74-75页 |
| 2.9.3 实验中所用克隆引物列表 | 第75-76页 |
| 2.9.4 实验中所用qPCR引物列表 | 第76-80页 |
| 2.9.5 实验中所用gRNA引物列表 | 第80-82页 |
| 2.9.6 实验中所用斑马鱼突变体鉴定引物列表 | 第82-87页 |
| 第3章 △113p53/△133p53促进DNA双链修复的分子机制 | 第87-97页 |
| 3.1 △113p53/△133p53可以被DNA双链断裂损伤胁迫激活表达 | 第87-89页 |
| 3.2 斑马鱼及人类细胞系中△113p53/△133p53促进DNA双链断裂修复 | 第89-90页 |
| 3.3 △113p53/△133p53促进DNA双链断裂修复关键基因的表达 | 第90-92页 |
| 3.4 △113p53可通过直接结合修复基因启动子从而调控相关修复基因表达 | 第92-94页 |
| 3.5 小结和讨论 | 第94-97页 |
| 第4章 △133p53协同p73促进DNA双链断裂修复 | 第97-118页 |
| 4.1 p73在γ-辐照处理后蛋白水平和mRNA水平都发生上调 | 第97-100页 |
| 4.1.1 γ-辐照后细胞的p73α被转录激活 | 第97-98页 |
| 4.1.2 p73在γ-辐照处理后蛋白水平增加 | 第98-99页 |
| 4.1.3 △133p53及p53的表达不依赖于p73 | 第99-100页 |
| 4.2 p73与/△133p53协同促进DNA双链断裂修复 | 第100-104页 |
| 4.2.1 △133p53促进双链断裂修复依赖于p73 | 第100-102页 |
| 4.2.2 p73与△133p53共表达促进了DNA双链断裂修复 | 第102-104页 |
| 4.3 p73与△133p53的蛋白互作 | 第104-106页 |
| 4.3.1 外源过表达的△133p53与p73可形成蛋白复合物 | 第104-105页 |
| 4.3.2 内源性的△133p53与p73可形成蛋白复合物 | 第105-106页 |
| 4.4 DNA DSB胁迫时敲低p7增加DNA损伤积累并加速细胞衰老 | 第106-112页 |
| 4.4.1 DNA DSB胁迫时p73促进DNA修复Foci的形成并减少损伤位点的Foci | 第106-108页 |
| 4.4.2 DNA DSB胁迫时p73减少DNA损伤的积累 | 第108-110页 |
| 4.4.3 DNA DSB胁迫时p73保护细胞免于衰老 | 第110-112页 |
| 4.5 p73与△133p53协同促进DNA双链断裂修复基因的表达 | 第112-113页 |
| 4.6 p73与△133p53相互作用协同促进调控DNA双链断裂修复途径关键基因的转录 | 第113-116页 |
| 4.6.1 外源过表达△133p53可协同p73结合至Lig4、Rad51以及Rad52启动子 | 第114-115页 |
| 4.6.2 内源性△133p53促进p73在Lig4、Rad51以及Rad52启动子上基序的结合 | 第115-116页 |
| 4.7 小结与讨论 | 第116-118页 |
| 第5章 利用cas9技术构建22种基因敲除型斑马鱼 | 第118-126页 |
| 5.1 gRNA的设计以及F0代突变效率的检测 | 第118-121页 |
| 5.2 F1代突变体以及F2代突变体筛选及鉴定 | 第121-123页 |
| 5.3 F2代突变体基因型总结 | 第123-124页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第124-126页 |
| 第6章 总结与讨论 | 第126-130页 |
| 6.1 结论 | 第126-128页 |
| 6.2 讨论 | 第128-130页 |
| 参考文献 | 第130-140页 |
| 作者简介 | 第140-141页 |
| 致谢 | 第141-142页 |
