| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-9页 |
| 第一章 研究背景及进展 | 第14-32页 |
| 1.1 基因组编辑技术 | 第14页 |
| 1.2 人工核酸内切酶技术的发展 | 第14-19页 |
| 1.2.1 锌指核酸酶技术（ZFNs） | 第14-15页 |
| 1.2.2 类转录激活因子核酸酶技术（TELENs） | 第15-16页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9核酸酶技术（CRISPR/Cas9） | 第16-19页 |
| 1.3 DNA双链断裂的修复机制 | 第19-22页 |
| 1.3.1 非同源末端链接（NHEJ）修复 | 第20-21页 |
| 1.3.2 单链退火拟合（SSA）修复 | 第21页 |
| 1.3.3 同源介导修复（HDR）修复 | 第21-22页 |
| 1.4 提高HDR效率的策略 | 第22-25页 |
| 1.4.1 核酸酶结构优化 | 第22-23页 |
| 1.4.2 抑制NHEJ通路 | 第23-24页 |
| 1.4.3 强化HDR通路 | 第24页 |
| 1.4.4 重组蛋白Rad52 | 第24-25页 |
| 1.5 HDR供体类型及选择 | 第25-29页 |
| 1.5.1 环状质粒供体 | 第26-27页 |
| 1.5.2 线性化质粒供体 | 第27-28页 |
| 1.5.3 PCR产物供体 | 第28页 |
| 1.5.4 单链寡核苷酸供体 | 第28-29页 |
| 1.6 CRISPR/Cas9介导的畜禽基因组精确编辑 | 第29-31页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第31-32页 |
| 第二章 猪IGF2基因编辑系统的构建及初步应用 | 第32-56页 |
| 2.1 试验材料 | 第33-35页 |
| 2.1.1 试验菌株、质粒和细胞系 | 第33页 |
| 2.1.2 试验试剂及主要试剂配制 | 第33-34页 |
| 2.1.3 试验涉及主要仪器 | 第34-35页 |
| 2.1.4 引物合成与使用 | 第35页 |
| 2.2 试验方法 | 第35-45页 |
| 2.2.1 关中黑猪基因组中IGF2基因内含子3中 3072 位碱基序列的鉴定 | 第35-37页 |
| 2.2.2 基于CRISPR/StCas9的真核表达载体构建 | 第37-40页 |
| 2.2.3 双荧光报告载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.4 嘌呤霉素富集筛选载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.5 供体质粒的构建 | 第42-43页 |
| 2.2.6 细胞的分离、培养及传代 | 第43-44页 |
| 2.2.7 细胞转染 | 第44-45页 |
| 2.2.8 猪肾原代成纤维细胞嘌呤霉素的筛选 | 第45页 |
| 2.2.9 PCR扩增基因组靶序列及测序 | 第45页 |
| 2.3 试验结果 | 第45-54页 |
| 2.3.1 关中黑猪IGF2基因内含子3中 3072 位的PCR扩增及序列鉴定 | 第45-47页 |
| 2.3.2 CRISPR/StCas9真核表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.3.3 双荧光报告载体的构建 | 第48-49页 |
| 2.3.4 CRISPR/StCas9真核表达载体的活性检测 | 第49-50页 |
| 2.3.5 嘌呤霉素富集筛选载体的构建 | 第50页 |
| 2.3.6 供体质粒的构建 | 第50-51页 |
| 2.3.7 猪肾原代成纤维细胞的分离培养 | 第51-52页 |
| 2.3.8 猪肾原代成纤维细胞的嘌呤霉素筛选 | 第52-53页 |
| 2.3.9 猪肾原代成纤维细胞基因组的测序结果 | 第53-54页 |
| 2.4 讨论 | 第54-55页 |
| 2.5 小结 | 第55-56页 |
| 第三章 新型ScRad52-Cas9精确编辑系统的建立 | 第56-74页 |
| 3.1 试验材料 | 第57页 |
| 3.1.1 试验菌株、质粒和细胞系 | 第57页 |
| 3.1.2 试验试剂及主要试剂配制 | 第57页 |
| 3.2 试验方法 | 第57-65页 |
| 3.2.1 酵母ScRad52基因的克隆 | 第57-58页 |
| 3.2.2 酵母ScRad52真核表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 3.2.3 CRISPR/SpCas9真核表达载体的构建 | 第59-61页 |
| 3.2.4 供体整合型双荧光重组效率检测报告载体的构建 | 第61-63页 |
| 3.2.5 供体分离型单荧光重组效率检测报告载体的构建 | 第63-65页 |
| 3.2.6 细胞培养 | 第65页 |
| 3.2.7 细胞转染 | 第65页 |
| 3.2.8 流式细胞仪检测 293T细胞中报告载体的修复效率 | 第65页 |
| 3.3 试验结果 | 第65-72页 |
| 3.3.1 两套荧光重组效率检测系统功能验证 | 第65-68页 |
| 3.3.2 报告载体水平检测共表达ScRad52蛋白策略增强CRISPR/Cas9介导的HDR效率 | 第68-69页 |
| 3.3.3 蛋白融合表达ScRad52-Cas9策略增强HDR效率 | 第69-70页 |
| 3.3.4 报告载体水平检测ScRad52-Cas9融合表达策略增强HDR效率 | 第70-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-73页 |
| 3.5 小结 | 第73-74页 |
| 第四章 ScRad52-Cas9精确编辑系统在HEK293T细胞中的功能验证 | 第74-92页 |
| 4.1 试验材料 | 第75页 |
| 4.1.1 试验菌株、质粒和细胞系 | 第75页 |
| 4.1.2 试验试剂及主要试剂配制 | 第75页 |
| 4.2 试验方法 | 第75-81页 |
| 4.2.1 CRISPR/Cas9真核表达载体的构建 | 第75-77页 |
| 4.2.2 SSA-based RPG载体的构建 | 第77-78页 |
| 4.2.3 不同类型供体模板的构建及合成 | 第78-80页 |
| 4.2.4 细胞培养 | 第80页 |
| 4.2.5 嘌呤霉素作用于HEK293T细胞的最佳筛选浓度 | 第80页 |
| 4.2.6 细胞转染 | 第80页 |
| 4.2.7 HEK293T细胞嘌呤霉素的筛选 | 第80-81页 |
| 4.2.8 HEK293T细胞基因组的提取 | 第81页 |
| 4.2.9 HEK293T细胞基因组靶序列的扩增 | 第81页 |
| 4.2.10 酶切检测试验 | 第81页 |
| 4.2.11 T-A克隆测序检测基因组中的突变 | 第81页 |
| 4.3 试验结果 | 第81-90页 |
| 4.3.1 质粒供体PAM位及其后3位碱基替换成XbaⅠ酶切位点碱基序列的测序验证 | 第81-82页 |
| 4.3.2 嘌呤霉素作用于HEK293T细胞的最佳筛选浓度及时间 | 第82-83页 |
| 4.3.3 ScRad52和CRISPR/Cas9共表达或融合表达增强VEGF位点HDR效率 | 第83-84页 |
| 4.3.4 ScRad52和CRISPR/Cas9共表达或融合表达增强CCR5位点HDR效率 | 第84-85页 |
| 4.3.5 ScRad-Cas9融合表达策略介导的HEK293T基因组精确编辑的测序分析 | 第85-86页 |
| 4.3.6 Scr7协同质粒供体或PCR供体为模板的高效精确编辑系统的HDR效率研究 | 第86-89页 |
| 4.3.7 单链ssDNA为供体模板的高效精确编辑系统的HDR效率研究 | 第89-90页 |
| 4.4 讨论 | 第90-91页 |
| 4.5 小结 | 第91-92页 |
| 第五章 基于ScRad52-Cas9系统的猪IGF2基因高效编辑 | 第92-104页 |
| 5.1 试验材料 | 第93页 |
| 5.1.1 试验菌株、质粒和细胞系 | 第93页 |
| 5.1.2 试验试剂及主要试剂配制 | 第93页 |
| 5.2 试验方法 | 第93-97页 |
| 5.2.1 CRISPR/Cas9真核表达载体的构建 | 第93-94页 |
| 5.2.2 SSA-based RPG载体的构建 | 第94-95页 |
| 5.2.3 供体质粒的构建 | 第95-96页 |
| 5.2.4 细胞分离、培养、传代及基因型鉴定 | 第96页 |
| 5.2.5 嘌呤霉素作用于PK-15 细胞的最佳筛选浓度 | 第96-97页 |
| 5.2.6 细胞转染 | 第97页 |
| 5.2.7 PK-15 猪细胞嘌呤霉素的筛选 | 第97页 |
| 5.2.8 猪细胞基因组的提取 | 第97页 |
| 5.2.9 猪细胞基因组靶序列的扩增 | 第97页 |
| 5.2.10 T-A克隆测序检测基因组中的突变 | 第97页 |
| 5.3 试验结果 | 第97-102页 |
| 5.3.1 质粒供体的构建及测序 | 第97-98页 |
| 5.3.2 嘌呤霉素作用于PK-15 细胞的最佳筛选浓度 | 第98-99页 |
| 5.3.3 精确编辑系统在猪PK-15 细胞中的应用 | 第99-100页 |
| 5.3.4 PK-15 猪细胞基因组的测序及分析 | 第100-101页 |
| 5.3.5 猪肾原代成纤维细胞基因组的精确编辑及测序结果 | 第101-102页 |
| 5.4 讨论 | 第102-103页 |
| 5.5 小结 | 第103-104页 |
| 结论和创新点 | 第104-105页 |
| 下一步研究计划 | 第105-106页 |
| 缩略词 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-118页 |
| 致谢 | 第118-120页 |
| 作者简介 | 第120-121页 |
