| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-28页 |
| 1.1. 基因组编辑技术 | 第12-22页 |
| 1.1.1. 基因组编辑工具简介 | 第12-15页 |
| 1.1.2. CRISPR-Cas基因组编辑技术 | 第15-22页 |
| 1.1.2.1. CRISPR-Cas9的结构及原理 | 第16-17页 |
| 1.1.2.2. CRISPR-Cas9的发展及应用 | 第17-19页 |
| 1.1.2.3. CRISPR-Cas9介导重组工程 | 第19-20页 |
| 1.1.2.4. CRISPR-Cas9结合NHEJ介导基因删除 | 第20-22页 |
| 1.2. 基因重组技术 | 第22-26页 |
| 1.2.1. RecA介导的重组工程 | 第22-23页 |
| 1.2.2. 噬菌体重组系统 | 第23-26页 |
| 1.2.2.1. RecET介导的dsDNA重组技术 | 第24-25页 |
| 1.2.2.2. RecT介导的ssDNA重组技术 | 第25-26页 |
| 1.3. 本论文的选题背景、研究内容及意义 | 第26-28页 |
| 第二章 材料与方法 | 第28-46页 |
| 2.1. 实验材料 | 第28-38页 |
| 2.1.1. 本实验所使用的菌株和质粒 | 第28-29页 |
| 2.1.2. 本实验所用到的引物 | 第29-32页 |
| 2.1.3. 分子生物操作技术常用酶 | 第32页 |
| 2.1.4. 常用试剂盒 | 第32页 |
| 2.1.5. 常用生化试剂与药品 | 第32-33页 |
| 2.1.6. 培养基及实验室常用试剂配方 | 第33-37页 |
| 2.1.7. 本实验所用抗生素以及其它药品试剂的配方 | 第37页 |
| 2.1.8. 本实验所用到的仪器和设备 | 第37-38页 |
| 2.2. 实验方法 | 第38-46页 |
| 2.2.1. 菌种的保藏方法 | 第38-39页 |
| 2.2.2. PCR扩增体系和条件 | 第39-40页 |
| 2.2.3. 重组PCR方法 | 第40页 |
| 2.2.4. DN片段回收 | 第40页 |
| 2.2.4.1. PCR产物纯化回收 | 第40页 |
| 2.2.4.2. 琼脂糖凝胶DNA产物回收 | 第40页 |
| 2.2.5. 限制性内切酶酶切体系及方法 | 第40-41页 |
| 2.2.6. T4 DNA Ligase连接反应体系及方法 | 第41页 |
| 2.2.7. 优化gRNA组装方法 | 第41-42页 |
| 2.2.7.1. Spacer退火反应体系 | 第41页 |
| 2.2.7.2. 靶位点一步组装 | 第41-42页 |
| 2.2.8. 细菌质粒和基因组的提取 | 第42-43页 |
| 2.2.8.1. 质粒小提试剂盒 | 第42页 |
| 2.2.8.2. 质粒小提中量试剂盒 | 第42-43页 |
| 2.2.8.3. 革兰氏阳性菌质粒小提试剂盒 | 第43页 |
| 2.2.8.4. 细菌基因组DNA的提取 | 第43页 |
| 2.2.9. 大肠杆菌的常规转化 | 第43-44页 |
| 2.2.9.1. 化学转化法 | 第43页 |
| 2.2.9.2. 电击转化法 | 第43-44页 |
| 2.2.10. 重组子的筛选与鉴定 | 第44页 |
| 2.2.11. 谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 2.2.12. 谷氨酸棒状杆菌的电击转化 | 第45-46页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第46-72页 |
| 3.1. 谷氨酸棒状杆菌中CR-NHEJ系统的探索应用 | 第46-59页 |
| 3.1.1. CRISPR-Cas9在谷氨酸棒状杆菌中的功能验证 | 第46-49页 |
| 3.1.1.1. Cas9表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.1.1.2. CRISPR-Cas9靶位点的设计及验证 | 第47-49页 |
| 3.1.2. NHEJ系统在谷氨酸棒状杆菌中的功能验证 | 第49-57页 |
| 3.1.2.1. NHEJ表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 3.1.2.2. 异源表达lacZ基因验证NHEJ系统 | 第50-57页 |
| 3.1.3. CR-NHEJ系统进行基因敲除的探索 | 第57-59页 |
| 3.2. 谷氨酸棒状杆菌中CRISPR-Cas9辅助的ssDNA重组技术的探索 | 第59-72页 |
| 3.2.1. ssDNA重组技术的建立 | 第60-66页 |
| 3.2.1.1. 突变标记基因的选择 | 第60-62页 |
| 3.2.1.2. 介导ssDNA重组载体的构建 | 第62-63页 |
| 3.2.1.3. ssDNA重组技术的验证 | 第63-66页 |
| 3.2.2. CRISPR-Cas9用于重组子筛选的功能验证 | 第66-69页 |
| 3.2.3. CRISPR-Cas9辅助的ssDNA重组技术优化 | 第69-72页 |
| 全文总结 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 攻读研究生硕士期间发表的学术论文 | 第79页 |
