| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩略词 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-24页 |
| 1.1 γ-氨基丁酸 | 第16-18页 |
| 1.1.1 γ-氨基丁酸结构与性质 | 第16页 |
| 1.1.2 γ-氨基丁酸的生理作用 | 第16-17页 |
| 1.1.3 γ-氨基丁酸的应用 | 第17页 |
| 1.1.4 γ-氨基丁酸的制备 | 第17-18页 |
| 1.2 谷氨酸脱羧酶 | 第18-19页 |
| 1.3 大肠杆菌中重组蛋白的可溶性表达 | 第19-21页 |
| 1.3.1 优化表达条件 | 第19-20页 |
| 1.3.2 使用分子伴侣或折叠酶共表达 | 第20页 |
| 1.3.3 融合标签技术 | 第20-21页 |
| 1.3.4 周质空间和胞外分泌性表达 | 第21页 |
| 1.4 酶固定化技术 | 第21-22页 |
| 1.4.1 酶固定化技术概述 | 第21页 |
| 1.4.2 酶固定化的方法 | 第21-22页 |
| 1.5 选题依据及研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 重组大肠杆菌的构建表达 | 第24-42页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.2.2 酶、试剂盒和药品 | 第24-25页 |
| 2.2.3 主要实验仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.4 培养基和试剂配制 | 第26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-34页 |
| 2.3.1 Lactobacillus plantarum 22144和E.coli AS1.505基因组的提取 | 第26-27页 |
| 2.3.2 谷氨酸脱羧酶基因gad的克隆 | 第27-28页 |
| 2.3.3 重组质粒pET-28a-22144-gad和pET-28a-AS1.505-gad的构建 | 第28-30页 |
| 2.3.4 重组质粒pET-28a-22144-gad和pET-28a-AS1.505-gad的验证 | 第30-31页 |
| 2.3.5 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)的构建表达 | 第31-32页 |
| 2.3.6 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)的谷氨酸脱羧酶活力比较 | 第32-34页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第34-41页 |
| 2.4.1 gad基因的克隆 | 第34-35页 |
| 2.4.2 重组质粒pET-28a-22144-gad和pET-28a-AS1.505-gad的构建 | 第35-37页 |
| 2.4.3 22144-gad和AS1.505-gad序列分析 | 第37-39页 |
| 2.4.4 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28 a-AS1.505-gad)的构建表达 | 第39-40页 |
| 2.4.5 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)酶活比较 | 第40-41页 |
| 2.5 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 大肠杆菌中重组GAD蛋白的可溶性表达研究 | 第42-67页 |
| 3.1 前言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第42-43页 |
| 3.2.2 酶、试剂盒和药品 | 第43页 |
| 3.2.3 主要实验仪器 | 第43-44页 |
| 3.2.4 培养基和试剂配制 | 第44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-51页 |
| 3.3.1 E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad,△pelB)和E.coli BL21(DE3)(pET-22b- 22144-gad)的构建表达 | 第44-47页 |
| 3.3.1.1 gad基因克隆 | 第44-45页 |
| 3.3.1.2 重组质粒pET-22b-22144-gad(△pelB)和pET-22b-22144-gad的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.1.3 重组质粒pET-22b-22144-gad(△pelB)和pET-22b-22144-gad的验证 | 第46-47页 |
| 3.3.1.4 E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad,△pelB)的构建表达 | 第47页 |
| 3.3.2 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-SUMO-22144-gad)、E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144-gad(TGA)和E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-2144-gad)的构建表达 | 第47-50页 |
| 3.3.2.1 gad基因克隆 | 第47-48页 |
| 3.3.2.2 重组质粒pET-28a-SUMO-22144-gad、pMAL-c2X-22144-gad和pMAL- c2X-22144-gad(TGA)的构建 | 第48-49页 |
| 3.3.2.3 重组质粒pET-28a-SUMO-22144-gad、pMAL-c2X-22144-gad和pMAL- c2X-22144-gad(TGA)的验证 | 第49-50页 |
| 3.3.2.4 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-SUMO-22144-gad)、E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144 -gad(TGA)的构建表达 | 第50页 |
| 3.3.3 E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)的构建表达 | 第50页 |
| 3.3.4 生长曲线的测定 | 第50页 |
| 3.3.5 重组大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶活力比较 | 第50-51页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第51-66页 |
| 3.4.1 E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad,△pelB) 和 E.coli BL21(DE3)(pET- 22b-22144-gad)的构建表达 | 第51-53页 |
| 3.4.2 E.coli BL21(DE3)(pET-28a-SUMO-22144-gad)的构建表达 | 第53-57页 |
| 3.4.3 E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144-gad和E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X- 22144-gad(TGA)的构建表达 | 第57-60页 |
| 3.4.4 E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)的构建表达 | 第60-61页 |
| 3.4.5 生长曲线的测定 | 第61-63页 |
| 3.4.6 重组大肠杆菌的GAD酶活力比较 | 第63-66页 |
| 3.4.6.1 重组大肠杆菌的GAD可溶性表达 | 第63-64页 |
| 3.4.6.2 GAD酶活力比较 | 第64-66页 |
| 3.5 本章小结 | 第66-67页 |
| 第四章 E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a- 22144-gad)蛋白表达及细胞破碎条件的优化 | 第67-76页 |
| 4.1 前言 | 第67页 |
| 4.2 材料和方法 | 第67-68页 |
| 4.2.1 菌株 | 第67页 |
| 4.2.2 药品 | 第67-68页 |
| 4.2.3 主要实验器材 | 第68页 |
| 4.2.4 培养基和试剂配制 | 第68页 |
| 4.3 实验方法 | 第68-69页 |
| 4.3.1 温度对E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)诱导表达的影响 | 第68页 |
| 4.3.2 IPTG对E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)诱导表达的影响 | 第68-69页 |
| 4.3.3 缓冲液对E.coli BL21 (DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)细胞破碎的影响 | 第69页 |
| 4.3.4 GAD的最适催化pH | 第69页 |
| 4.3.5 GAD的最适催化温度 | 第69页 |
| 4.4 实验结果 | 第69-75页 |
| 4.4.1 不同诱导温度及破碎缓冲液对重组GAD蛋白的影响 | 第69-72页 |
| 4.4.2 IPTG浓度对重组GAD蛋白表达的影响 | 第72-73页 |
| 4.4.3 GAD的最适催化pH | 第73-74页 |
| 4.4.4 GAD的最适催化温度 | 第74-75页 |
| 4.5 本章小结 | 第75-76页 |
| 第五章 谷氨酸脱羧酶的固定化 | 第76-97页 |
| 5.1 前言 | 第76页 |
| 5.2 材料和方法 | 第76-77页 |
| 5.2.1 菌株及树脂 | 第76-77页 |
| 5.2.2 药品 | 第77页 |
| 5.2.3 主要实验器材 | 第77页 |
| 5.2.4 培养基和试剂配制 | 第77页 |
| 5.3 实验方法 | 第77-82页 |
| 5.3.1 阴离子交换树脂固定GAD | 第77-78页 |
| 5.3.2 阳离子交换树脂固定GAD | 第78-79页 |
| 5.3.3 环氧基树脂固定GAD | 第79页 |
| 5.3.4 氨基化树脂固定GAD | 第79-80页 |
| 5.3.5 单因素实验 | 第80页 |
| 5.3.5.1 固定化温度对酶固定化的影响 | 第80页 |
| 5.3.5.2 固定化时间对酶固定化的影响 | 第80页 |
| 5.3.5.3 酶和载体的比例对酶固定化的影响 | 第80页 |
| 5.3.6 Box-Behnken试验设计 | 第80-81页 |
| 5.3.7 固定化谷氨酸脱羧酶的酶学性质 | 第81页 |
| 5.3.7.1 IGAD的最适催化pH | 第81页 |
| 5.3.7.2 IGAD的酸碱稳定性 | 第81页 |
| 5.3.7.3 IGAD的最适催化温度 | 第81页 |
| 5.3.7.4 IGAD的热稳定性 | 第81页 |
| 5.3.7.5 IGAD的重复利用稳定性 | 第81页 |
| 5.3.8 IGAD转化生产GABA | 第81-82页 |
| 5.4 实验结果 | 第82-95页 |
| 5.4.1 固定化载体的选择 | 第82-85页 |
| 5.4.2 单因素实验 | 第85-87页 |
| 5.4.2.1 固定化温度对酶固定化的影响 | 第85页 |
| 5.4.2.2 固定化时间对酶固定化的影响 | 第85-86页 |
| 5.4.2.3 酶和载体的比例对酶固定化的影响 | 第86-87页 |
| 5.4.3 GAD固定化响应面优化分析 | 第87-91页 |
| 5.4.3.1 Box-Benhnken试验各因素值的确定 | 第87页 |
| 5.4.3.2 确定回归模型及方差分析 | 第87-90页 |
| 5.4.3.3 响应面试验的结果分析 | 第90-91页 |
| 5.4.4 IGAD酶学性质的研究 | 第91-95页 |
| 5.4.4.1 IGAD的最适催化pH | 第91-92页 |
| 5.4.4.2 IGAD的酸碱稳定性 | 第92-93页 |
| 5.4.4.3 IGAD的最适催化温度 | 第93页 |
| 5.4.4.4 IGAD的热稳定性 | 第93-94页 |
| 5.4.4.5 IGAD的重复利用稳定性 | 第94-95页 |
| 5.4.5 IGAD转化生产GABA | 第95页 |
| 5.5 小结 | 第95-97页 |
| 第六章 总结与展望 | 第97-99页 |
| 6.1 全文总结 | 第97-98页 |
| 6.2 创新点 | 第98页 |
| 6.3 研究不足与展望 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第107页 |
