| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 淀粉酶 | 第10-12页 |
| 1.1.1 淀粉酶的来源以及分类 | 第10-11页 |
| 1.1.2 生淀粉酶研究的现状以及前景 | 第11-12页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统及其优化 | 第12-13页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统的优点 | 第12-13页 |
| 1.3 影响目的外源蛋白在毕赤酵母表达产量的因素以及策略 | 第13-20页 |
| 1.3.1 启动子的选择 | 第13-14页 |
| 1.3.2 密码子优化 | 第14-15页 |
| 1.3.3 基因拷贝数 | 第15-16页 |
| 1.3.4 蛋白折叠与分泌 | 第16-20页 |
| 1.4 立题背景和意义 | 第20-22页 |
| 第2章 毕赤酵母表达Gs4j-amyA密码子优化及基因拷贝数定量分析 | 第22-34页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第22-26页 |
| 2.2.1 实验菌株、质粒和试剂 | 第22页 |
| 2.2.2 培养基以及缓冲液 | 第22-23页 |
| 2.2.3 密码子优化 | 第23页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态制备以及转化 | 第23-24页 |
| 2.2.5 PCR反应体系以及无缝克隆体系 | 第24页 |
| 2.2.6 毕赤酵母感受态制备及电转化 | 第24-25页 |
| 2.2.7 毕赤酵母基因组提取方法 | 第25页 |
| 2.2.8 分析检测方法基因拷贝数确定 | 第25-26页 |
| 2.2.9 毕赤酵母摇瓶培养 | 第26页 |
| 2.2.10 酶活测定 | 第26页 |
| 2.2.11 本章所用到的引物 | 第26页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第26-33页 |
| 2.3.1 密码子优化结果分析 | 第26-27页 |
| 2.3.2 基因拷贝数标准曲线的确立 | 第27-30页 |
| 2.3.3 pPIC9K-opt-amyA与pPIC9K-ori-amyA质粒的构建 | 第30页 |
| 2.3.4 毕赤酵母GS-ori-A1与GS-opt-A1菌株拷贝数确定 | 第30-33页 |
| 2.3.5 毕赤酵母GS-ori-A1与GS-opt-A1菌株的摇瓶培养 | 第33页 |
| 2.4 本章小结 | 第33-34页 |
| 第3章 毕赤酵母表达Gs4j-amyA高拷贝菌株的构建 | 第34-42页 |
| 3.1 前言 | 第34页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第34-36页 |
| 3.2.1 实验菌株、质粒和试剂 | 第34页 |
| 3.2.2 培养基和缓冲液 | 第34页 |
| 3.2.3 高拷贝菌株的筛选 | 第34-35页 |
| 3.2.4 基因转录分析 | 第35页 |
| 3.2.5 5-L反应器发酵培养 | 第35页 |
| 3.2.6 蛋白浓度和酶活测定 | 第35-36页 |
| 3.2.7 引物 | 第36页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第36-41页 |
| 3.3.1 毕赤酵母不同opt-amyA基因拷贝数菌株的构建 | 第36页 |
| 3.3.2 基因拷贝数对于淀粉酶产量的影响 | 第36-37页 |
| 3.3.3 不同拷贝数生淀粉酶基因菌株的淀粉酶转录分析 | 第37-38页 |
| 3.3.4 5-L生物反应器高密度培养发酵 | 第38-41页 |
| 3.4 本章小结 | 第41-42页 |
| 第4章 过表达内质网转录因子HAC1p促进Gs4j-amyA的表达 | 第42-51页 |
| 4.1 前言 | 第42页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第42-44页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第42-43页 |
| 4.2.2 高拷贝过表达转录因子HAC1p菌株的筛选 | 第43页 |
| 4.2.3 基因组精提取以及HAC1基因拷贝数确定 | 第43页 |
| 4.2.4 RNA总提与RT-qPCR分析 | 第43页 |
| 4.2.5 Aox酶活测定 | 第43-44页 |
| 4.2.6 5-L生物反应器高密度培养工艺 | 第44页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第44-49页 |
| 4.3.1 pPICZB-HAC1质粒构建 | 第44页 |
| 4.3.2 毕赤酵母过表达转录因子HAC1p菌株的验证 | 第44-45页 |
| 4.3.3 毕赤酵母过表达转录因子HAC1p菌株拷贝数的验证 | 第45页 |
| 4.3.4 毕赤酵母不同拷贝数转录因子菌株的摇瓶培养 | 第45-46页 |
| 4.3.5 毕赤酵母不同拷贝数转录因子菌株的转录分析 | 第46-47页 |
| 4.3.6 5-L生物反应器高密度培养 | 第47-49页 |
| 4.4 本章小结 | 第49-51页 |
| 第5章 混合启动子过表达转录因子HAC1p促进Gs4j-amyA的表达 | 第51-56页 |
| 5.1 前言 | 第51页 |
| 5.2 实验材料和方法 | 第51-52页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第51页 |
| 5.2.2 无缝组装构建组成型过表达HAC1多表达盒质粒 | 第51页 |
| 5.2.3 毕赤酵母电转化及高拷贝菌株筛选 | 第51-52页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第52-55页 |
| 5.3.1 组成型启动子过表达HAC1p质粒的获得 | 第52-53页 |
| 5.3.2 混合启动子过表达HAC1p菌株的获得 | 第53页 |
| 5.3.3 混合启动子过表达HAC1p菌株摇瓶培养 | 第53-55页 |
| 5.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第6章 毕赤酵母表达的Gs4j-amyA的蛋白纯化和酶学性质分析 | 第56-63页 |
| 6.1 前言 | 第56页 |
| 6.2 实验材料与方法 | 第56-58页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第56页 |
| 6.2.2 蛋白镍柱纯化工艺 | 第56-57页 |
| 6.2.3 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第57页 |
| 6.2.4 蛋白质印迹法(Western Blot) | 第57-58页 |
| 6.2.5 Endo H法检验糖基化侧链 | 第58页 |
| 6.3 实验结果与讨论 | 第58-62页 |
| 6.3.1 蛋白纯化流程 | 第58-59页 |
| 6.3.2 蛋白分子量的确定 | 第59-60页 |
| 6.3.3 淀粉酶蛋白的酶动力学性质 | 第60-62页 |
| 6.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第7章 总结与展望 | 第63-65页 |
| 7.1 全文总结 | 第63页 |
| 7.2 展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
