| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 中英文对照表 | 第9-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-23页 |
| 1.1 兔病毒性出血症及检测方法的研究进展 | 第14-18页 |
| 1.1.1 病原学研究 | 第14-15页 |
| 1.1.2 流行病学研究 | 第15页 |
| 1.1.3 兔病毒性出血症的诊断方法 | 第15-18页 |
| 1.1.3.1 血清学诊断方法 | 第16-17页 |
| 1.1.3.2 分子生物学诊断方法 | 第17-18页 |
| 1.1.4 兔病毒性出血症的防制 | 第18页 |
| 1.2 RHDV2研究进展 | 第18-19页 |
| 1.3 实时荧光定量研究进展 | 第19-22页 |
| 1.3.1 SYBR Green Ⅰ荧光染料 | 第20-21页 |
| 1.3.2 TaqMan探针 | 第21-22页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第22-23页 |
| 第二章 RHDV2 SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立 | 第23-44页 |
| 2.1 材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 试剂 | 第23页 |
| 2.1.2 仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.3 试验动物 | 第24页 |
| 2.1.4 毒株 | 第24页 |
| 2.2 试验方法 | 第24-32页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第24-26页 |
| 2.2.2 培养基制备 | 第26页 |
| 2.2.2.1 LB培养基 | 第26页 |
| 2.2.2.2 氨苄平板的制备 | 第26页 |
| 2.2.3 RHDV2 VP60基因的人工合成 | 第26-27页 |
| 2.2.3.1 搭桥延伸 | 第26页 |
| 2.2.3.2 PCR扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.4 RHDV VP60靶基因的克隆 | 第27-30页 |
| 2.2.4.1 目的基因纯化回收 | 第27页 |
| 2.2.4.2 DH5α感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.4.3 目的基因与pMD19-T载体的连接 | 第28页 |
| 2.2.4.4 转化 | 第28页 |
| 2.2.4.5 重组质粒的抽提 | 第28-29页 |
| 2.2.4.6 重组质粒的鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.5 目的片段的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.5.1 RHDV2目的片段PCR扩增 | 第30页 |
| 2.2.5.2 RHDV PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.6 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 | 第31页 |
| 2.2.6.1 引物浓度的优化 | 第31页 |
| 2.2.6.2 退火温度的优化 | 第31页 |
| 2.2.7 标准品的制备 | 第31页 |
| 2.2.8 标准曲线的绘制 | 第31页 |
| 2.2.9 特异性试验 | 第31-32页 |
| 2.2.10 敏感性试验 | 第32页 |
| 2.2.11 重复性试验 | 第32页 |
| 2.2.12 临床样品检测 | 第32页 |
| 2.3 结果 | 第32-42页 |
| 2.3.1 RHDV靶基因的人工合成 | 第32-33页 |
| 2.3.2 重组质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.3 目的片段PCR扩增 | 第34-35页 |
| 2.3.3.1 RHDV2目的片段PCR扩增 | 第34页 |
| 2.3.3.2 RHDV目的片段PCR扩增 | 第34-35页 |
| 2.3.4 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 | 第35-37页 |
| 2.3.4.1 引物浓度优化 | 第35-36页 |
| 2.3.4.2 退火温度优化 | 第36-37页 |
| 2.3.5 标准品的制备 | 第37-38页 |
| 2.3.6 绘制标准曲线 | 第38-39页 |
| 2.3.7 特异性试验 | 第39-40页 |
| 2.3.8 敏感性试验 | 第40页 |
| 2.3.9 重复性试验 | 第40-41页 |
| 2.3.10 临床样品检测 | 第41-42页 |
| 2.4 讨论 | 第42-44页 |
| 第三章 RHDV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 | 第44-60页 |
| 3.1 材料 | 第44页 |
| 3.1.1 试剂 | 第44页 |
| 3.1.2 仪器 | 第44页 |
| 3.1.3 毒种与质粒 | 第44页 |
| 3.2 试验方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第44-45页 |
| 3.2.2 培养基的制备 | 第45页 |
| 3.2.3 RHDV VP60基因片段的PCR扩增 | 第45-46页 |
| 3.2.4 RHDV VP60目的基因的克隆 | 第46页 |
| 3.2.5 简并引物的PCR扩增 | 第46页 |
| 3.2.6 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 | 第46-47页 |
| 3.2.6.1 引物浓度的优化 | 第46-47页 |
| 3.2.6.2 退火温度的优化 | 第47页 |
| 3.2.7 标准品的制备 | 第47页 |
| 3.2.8 标准曲线的绘制 | 第47页 |
| 3.2.9 特异性试验 | 第47页 |
| 3.2.10 敏感性试验 | 第47页 |
| 3.2.11 重复性试验 | 第47页 |
| 3.2.12 初步应用 | 第47-48页 |
| 3.3 结果 | 第48-58页 |
| 3.3.1 RHDV VP60基因的RT-PCR扩增 | 第48页 |
| 3.3.2 重组质粒的鉴定 | 第48-50页 |
| 3.3.2.1 PCR鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.2.2 测序鉴定 | 第49-50页 |
| 3.3.3 简并引物的PCR扩增 | 第50-51页 |
| 3.3.4 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 | 第51-53页 |
| 3.3.4.1 引物浓度优化 | 第51-52页 |
| 3.3.4.2 退火温度优化 | 第52-53页 |
| 3.3.5 标准品的制备 | 第53页 |
| 3.3.6 标准曲线的绘制 | 第53-54页 |
| 3.3.7 特异性试验 | 第54-55页 |
| 3.3.8 敏感性试验 | 第55页 |
| 3.3.9 重复性试验 | 第55-56页 |
| 3.3.10 初步应用 | 第56-58页 |
| 3.4 讨论 | 第58-60页 |
| 第四章 试验结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第71页 |
