| 致谢 | 第1-7页 |
| 前言 | 第7-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-18页 |
| 第1章 文献综述 | 第18-43页 |
| ·鞘脂质研究进展 | 第18-31页 |
| ·鞘脂质的结构 | 第18-19页 |
| ·鞘脂质的生物合成途径及相关酶类 | 第19-24页 |
| ·丝氨酸软脂酰转移酶(SPT) | 第19-20页 |
| ·3-酮基二氢鞘氨醇还原酶(3KSR) | 第20页 |
| ·二氢神经酰胺合成酶(DHCerS) | 第20-21页 |
| ·二氢神经酰胺脱氢酶(DHCD) | 第21页 |
| ·神经酰胺酶(CER) | 第21-22页 |
| ·鞘氨醇激酶(SK) | 第22页 |
| ·神经酰胺激酶(CK) | 第22页 |
| ·神经酰胺转移蛋白(CERT) | 第22-23页 |
| ·鞘磷脂合成酶(SMS) | 第23页 |
| ·鞘磷脂酶(SM) | 第23页 |
| ·鞘氨醇-1-磷酸裂解酶(SPL) | 第23-24页 |
| ·鞘脂质在细胞反应中的作用 | 第24-31页 |
| ·神经酰胺在细胞反应中的作用 | 第24-26页 |
| ·神经鞘氨醇在细胞反应中的作用 | 第26-29页 |
| ·磷酸鞘氨醇在细胞反应中的作用 | 第29-31页 |
| ·神经酰胺酶研究进展 | 第31-38页 |
| ·神经酰胺酶的生化特性 | 第31-34页 |
| ·酸性神经酰胺酶(Acid ceramidase,AC) | 第31-32页 |
| ·中性神经酰胺酶(Neutral ceramidase,NC) | 第32页 |
| ·碱性神经酰胺酶(Alkaline ceramidase,ACER) | 第32-34页 |
| ·神经酰胺酶在调节细胞反应中的作用 | 第34-38页 |
| ·酸性神经酰胺酶 | 第34-36页 |
| ·中性神经酰胺酶 | 第36-37页 |
| ·碱性神经酰胺酶 | 第37-38页 |
| ·果蝇鞘脂质代谢研究进展 | 第38-43页 |
| ·果蝇作为鞘脂质代谢研究材料的优点 | 第38-41页 |
| ·昆虫和果蝇的鞘脂质代谢 | 第41-43页 |
| 第2章 果蝇BWA基因的克隆及表达 | 第43-57页 |
| ·实验材料 | 第43-45页 |
| ·果蝇品系 | 第43页 |
| ·菌种、细胞系和真核表达系统 | 第43页 |
| ·试剂 | 第43-44页 |
| ·工具酶 | 第44页 |
| ·仪器设备 | 第44页 |
| ·试剂配制 | 第44-45页 |
| ·实验方法 | 第45-50页 |
| ·总RNA提取 | 第45-46页 |
| ·甲醛变性电泳检测 | 第46页 |
| ·总RNA浓度及纯度测定 | 第46页 |
| ·PCR引物设计 | 第46页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第46-47页 |
| ·PCR扩增 | 第47页 |
| ·PCR产物纯化及克隆 | 第47页 |
| ·感受态细胞制备(C_aCl_2法) | 第47-48页 |
| ·连接转化 | 第48页 |
| ·重组杆状病毒转移质粒pFastBacHT-BWA的构建 | 第48-49页 |
| ·重组Bacmid的获得 | 第49页 |
| ·昆虫细胞培养、转染及重组病毒的感染 | 第49页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第49页 |
| ·Western blot分析 | 第49-50页 |
| ·结果与分析 | 第50-55页 |
| ·总RNA提取 | 第50页 |
| ·BWA基因RT-PCR扩增及序列测定 | 第50-52页 |
| ·BWA基因序列分析 | 第52-53页 |
| ·重组杆状病毒转移载体的构建 | 第53-54页 |
| ·重组病毒Bacmid获得及重组Bacmid的转染、鉴定 | 第54-55页 |
| ·SDS-PAGEA及Western Blot分析 | 第55页 |
| ·讨论 | 第55-57页 |
| 第3章 BWA蛋白产物的神经酰胺酶活力测定 | 第57-67页 |
| ·实验材料 | 第57-59页 |
| ·真核表达系统 | 第57页 |
| ·试剂及其他 | 第57页 |
| ·试剂配制 | 第57-59页 |
| ·仪器设备 | 第59页 |
| ·实验方法 | 第59-61页 |
| ·Tn细胞microsomes提取 | 第59页 |
| ·BCA测定蛋白浓度 | 第59-60页 |
| ·酶反应底物制备 | 第60页 |
| ·酶反应 | 第60页 |
| ·鞘脂质提取及HPLC分析 | 第60-61页 |
| ·标准曲线绘制 | 第61页 |
| ·回收率计算 | 第61页 |
| ·结果与分析 | 第61-65页 |
| ·HPLC条件的建立 | 第61-62页 |
| ·BWA蛋白产物神经酰胺酶的活力测定 | 第62-63页 |
| ·BWA蛋白产物酶反应最适pH值测定 | 第63-65页 |
| ·果蝇碱性神经酰胺酶最适底物的测定 | 第65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| 第4章 DaCER基因亚细胞定位及表达时相 | 第67-75页 |
| ·实验材料 | 第67-68页 |
| ·真核表达系统 | 第67页 |
| ·果蝇 | 第67页 |
| ·试剂 | 第67-68页 |
| ·工具酶 | 第68页 |
| ·仪器设备 | 第68页 |
| ·实验方法 | 第68-70页 |
| ·融合表达质粒pEGFP-C1-DaCER的构建 | 第68页 |
| ·DaCER在HeLa细胞中的亚细胞定位 | 第68-69页 |
| ·总RNA提取 | 第69页 |
| ·反转录合成cDNA第一链 | 第69页 |
| ·引物设计 | 第69-70页 |
| ·Real time-PCR体系建立 | 第70页 |
| ·数据分析 | 第70页 |
| ·结果与分析 | 第70-73页 |
| ·pEGFP-C1-DaCER重组质粒构建 | 第70-71页 |
| ·融合蛋白在HeLa细胞中的表达与定位 | 第71页 |
| ·DaCER基因在果蝇体内的表达时相 | 第71-73页 |
| ·讨论 | 第73-75页 |
| 第5章 DaCER对果蝇发育的影响 | 第75-79页 |
| ·实验材料 | 第75-76页 |
| ·果蝇 | 第75-76页 |
| ·无菌Petri dish-90mm | 第76页 |
| ·玉米粉培养基 | 第76页 |
| ·实验方法 | 第76-77页 |
| ·结果与分析 | 第77页 |
| ·讨论 | 第77-79页 |
| 第6章 DaCER对果蝇寿命和繁殖的影响 | 第79-84页 |
| ·实验材料 | 第79页 |
| ·实验方法 | 第79-80页 |
| ·果蝇处理 | 第79-80页 |
| ·数据处理 | 第80页 |
| ·结果与分析 | 第80-82页 |
| ·讨论 | 第82-84页 |
| 第7章 DaCER影响果蝇发育、寿命和繁殖机理的研究 | 第84-97页 |
| ·实验材料 | 第84-85页 |
| ·果蝇 | 第84页 |
| ·果蝇细胞 | 第84页 |
| ·试剂 | 第84页 |
| ·试剂配制 | 第84-85页 |
| ·仪器设备 | 第85页 |
| ·实验方法 | 第85-88页 |
| ·S2细胞复苏和冻存 | 第85-86页 |
| ·MAPP处理S2细胞 | 第86页 |
| ·MTT法测定细胞存活率 | 第86页 |
| ·HPLC分析MAPP处理的S2细胞的鞘脂质 | 第86页 |
| ·S2细胞中DaCER基因的RNA干扰 | 第86-87页 |
| ·DaCER基因下调后的S2细胞周期的分析 | 第87-88页 |
| ·结果与分析 | 第88-95页 |
| ·MTT检测MAPP对细胞存活率的影响 | 第88页 |
| ·MAPP处理对S2细胞鞘氨醇代谢的影响 | 第88-90页 |
| ·DaCER失活对果蝇鞘脂质代谢的影响 | 第90-92页 |
| ·DaCER失活对S2细胞周期的影响 | 第92-95页 |
| ·讨论 | 第95-97页 |
| 第8章 总结与讨论 | 第97-101页 |
| ·结论与讨论 | 第97-99页 |
| ·DaCER基因结构及蛋白功能的初步验证 | 第97页 |
| ·DaCER的定位及其对果蝇生理功能的影响 | 第97-98页 |
| ·DaCER影响果蝇生理功能机理的探究 | 第98-99页 |
| ·本论文的创新之处 | 第99-100页 |
| ·进一步研究方向 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-117页 |
