| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 引言和文献综述 | 第11-22页 |
| 1.1 基因敲除技术的概述 | 第11-14页 |
| 1.1.1 传统基因敲除技术简介 | 第11-12页 |
| 1.1.2 ZFN基因敲除技术简介 | 第12-13页 |
| 1.1.3 TALEN基因敲除技术简介 | 第13-14页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术 | 第14-18页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9技术简介 | 第14-16页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9技术原理 | 第16-18页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9技术的优势及前景 | 第18页 |
| 1.3 以斑马鱼为模式生物做基因敲除的优势 | 第18-20页 |
| 1.3.1 斑马鱼作为模式生物的发展历程 | 第18-19页 |
| 1.3.2 斑马鱼用来研究心脏发育的优势 | 第19-20页 |
| 1.4 hprg1基因简介及前期研究进展 | 第20-21页 |
| 1.4.1 hprg1基因的简介 | 第20页 |
| 1.4.2 hprg1基因的前期研究 | 第20-21页 |
| 1.5 本文研究的意义 | 第21-22页 |
| 2 材料和方法 | 第22-35页 |
| 2.1 材料 | 第22-24页 |
| 2.1.1 主要试剂、酶和试剂盒 | 第22-23页 |
| 2.1.2 主要实验仪器 | 第23页 |
| 2.1.3 菌株及质粒 | 第23页 |
| 2.1.4 斑马鱼品系 | 第23-24页 |
| 2.1.5 生物信息学分析主要数据库和主要软件 | 第24页 |
| 2.2 常规实验方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 斑马鱼基因组DNA的提取 | 第24-25页 |
| 2.2.2 基因组PCR | 第25页 |
| 2.2.3 PCR产物与PMD18-T载体连接 | 第25-26页 |
| 2.2.4 连接产物的转化 | 第26页 |
| 2.2.5 质粒DNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.6 酶切 | 第27页 |
| 2.2.7 酶切产物的纯化回收 | 第27-28页 |
| 2.2.8 PCR产物的纯化回收 | 第28页 |
| 2.2.9 mRNA的体外转录合成 | 第28-29页 |
| 2.2.10 mRNA的纯化 | 第29页 |
| 2.2.11 胚胎收集及显微注射 | 第29-30页 |
| 2.3 CRISPR/Cas9相关RNA合成方法 | 第30-32页 |
| 2.3.1 hprg1基因靶位点选择和设计 | 第30-31页 |
| 2.3.2 Cas-hprg1-gRNA的合成方法 | 第31-32页 |
| 2.3.3 hCas9mRNA的合成方法 | 第32页 |
| 2.4 hprg1基因打靶的有效性检测 | 第32-33页 |
| 2.5 hprg1基因敲除稳定系的建立 | 第33-34页 |
| 2.5.1 Cas-hprg1-F0代的鉴定分析及筛选方法 | 第33页 |
| 2.5.2 Cas-hprg1-F1代的鉴定分析及筛选方法 | 第33页 |
| 2.5.3 Cas-hprg1-F2代的鉴定分析及筛选方法 | 第33-34页 |
| 2.6 Cas-hprg1-F3代纯合子表型分析 | 第34-35页 |
| 2.6.1 Cas-hprg1-F3代纯合子死亡率统计 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-49页 |
| 3.1 hprg1基因的靶位点分析与设计 | 第35-36页 |
| 3.2 Cas-hprg1-gRNA和hCas9mRNA的合成 | 第36-37页 |
| 3.3 hprg1基因打靶的有效性检测及分析 | 第37-38页 |
| 3.4 Cas-hprg1-F0代的检测结果 | 第38-41页 |
| 3.5 Cas-hprg1-F1代的检测结果 | 第41-44页 |
| 3.6 Cas-hprg1-F2代的检测结果 | 第44-47页 |
| 3.7 Cas-hprg1-F3代纯合子死亡率统计 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 4.1 Cas-hprg1-F0代阳性嵌合体筛选分析 | 第49-50页 |
| 4.2 Cas-hprg1-F1代筛选分析 | 第50页 |
| 4.3 Cas-hprg1-F2代基因型鉴定及死亡率分析 | 第50-51页 |
| 5 结语 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-58页 |
| 附录一 | 第58-59页 |
| 附录二 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
