| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第1章 研究背景 | 第13-33页 |
| 1.1 TGF-β超家族及其功能简介 | 第13-17页 |
| 1.1.1 TGF-β的结构与表达 | 第13-15页 |
| 1.1.2 TGF-β信号转导 | 第15-17页 |
| 1.2 TGF-β调控上皮间质转化和肿瘤转移 | 第17-25页 |
| 1.2.1 EMT的发现与功能简介 | 第17-21页 |
| 1.2.2 TGF-β参与上皮间质转化和肿瘤转移的调控 | 第21-25页 |
| 1.3 泛素化修饰在TGF-β信号通路中的作用 | 第25-31页 |
| 1.3.1 泛素化系统简介 | 第28-29页 |
| 1.3.2 TGF-β信号通路中的泛素化调控 | 第29-31页 |
| 1.4 去泛素化酶USP2a的结构与功能简介 | 第31-33页 |
| 第2章 实验材料与实验方法 | 第33-47页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-34页 |
| 2.1.1 试剂和抗体 | 第33页 |
| 2.1.2 细胞培养及所需材料 | 第33-34页 |
| 2.1.3 小鼠 | 第34页 |
| 2.1.4 人肿瘤样本 | 第34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-47页 |
| 2.2.1 构建克隆 | 第34页 |
| 2.2.2 报告基因实验 | 第34-35页 |
| 2.2.3 pLenti-shRNA的构建 | 第35页 |
| 2.2.4 慢病毒感染构建稳定细胞系 | 第35-36页 |
| 2.2.5 CRISPR-Cas9细胞基因敲除 | 第36页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR | 第36-37页 |
| 2.2.7 免疫印迹(Immunoblot)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation) | 第37页 |
| 2.2.8 组织芯片(Tissue Microarray)和免疫组化(Immunohistochemistry) | 第37-38页 |
| 2.2.9 USP2a(pSer207)抗体的制备 | 第38-39页 |
| 2.2.10 蛋白纯化和体外磷酸化实验 | 第39页 |
| 2.2.11 体外去泛素化实验 | 第39页 |
| 2.2.12 蛋白纯化和体外激酶实验 | 第39-40页 |
| 2.2.13 细胞质膜分离实验 | 第40页 |
| 2.2.14 邻位连接实验(Proximity Ligation Assay,PLA) | 第40-41页 |
| 2.2.15 免疫荧光实验 | 第41页 |
| 2.2.16 基因敲除小鼠鉴定 | 第41-42页 |
| 2.2.17 制备小鼠肺成纤维细胞的方法 | 第42-43页 |
| 2.2.18 制备小鼠胚胎成纤维细胞的方法 | 第43页 |
| 2.2.19 小鼠肿瘤转移模型 | 第43-44页 |
| 2.2.20 质谱(Mass Spectrometry) | 第44-45页 |
| 2.2.21 PI染色检测细胞周期 | 第45-47页 |
| 第3章 实验结果 | 第47-90页 |
| 3.1 研究背景与立项依据 | 第47-49页 |
| 3.2 USP2a促进TGF-β信号通路的激活 | 第49-55页 |
| 3.2.1 过表达USP2a激活SMAD2/3/4报告基因 | 第49-51页 |
| 3.2.2 过表达USP2a促进TGF-β信号通路的激活 | 第51-52页 |
| 3.2.3 敲低USP2a抑制TGF-β信号通路的激活 | 第52-54页 |
| 3.2.4 敲除Usp2a抑制TGF-β信号通路的激活 | 第54-55页 |
| 3.3 USP2a促进TGF-β信号通路依赖去泛素化酶活性 | 第55-56页 |
| 3.4 TGFBR2磷酸化USP2a,从而促进TGF-β信号通路 | 第56-62页 |
| 3.4.1 TGF-β诱导USP2a发生磷酸化修饰 | 第56-57页 |
| 3.4.2 过表达USP2a(S207/S225A)不能激活TGF-β诱导的SMAD2/3/4报告基因 | 第57页 |
| 3.4.3 USP2a (S207/S225A)抑制TGF-β诱导的信号通路 | 第57-59页 |
| 3.4.4 在TGF-β诱导下,TGFBR2磷酸化USP2a | 第59-62页 |
| 3.5 USP2a介导TGFBR1和R-SMADs的相互作用 | 第62-66页 |
| 3.6 USP2a去泛素化TGFBR1 | 第66-73页 |
| 3.6.1 USP2a去除TGFBR1的K33-连接的泛素链 | 第66-68页 |
| 3.6.2 USP2a去除TGFBR1 Lys502位K33-连接的泛素链 | 第68-71页 |
| 3.6.3 USP2a通过去除TGFBR1 Lys502位K33-连接的泛素链促进SMAD2/3的招募 | 第71-73页 |
| 3.7 USP2a促进肿瘤转移 | 第73-79页 |
| 3.7.1 USP2a参与肿瘤转移 | 第73-75页 |
| 3.7.2 USP2a促进TGF-β诱导的EMT过程 | 第75-77页 |
| 3.7.3 敲除USP2a抑制肿瘤细胞的肺转移并延长成瘤小鼠的生存期 | 第77-79页 |
| 3.8 USP2a为治疗肿瘤转移提供新的靶点 | 第79-86页 |
| 3.8.1 ML364特异性地抑制TGF-β诱导的SMAD2/3/4报告基因的激活 | 第81-82页 |
| 3.8.2 ML364特异性地抑制TGF-β诱导的SMAD2的磷酸化以及EMT过程 | 第82页 |
| 3.8.3 ML364促进TGFBR1的K33-连接的多聚泛素链的形成 | 第82-84页 |
| 3.8.4 ML364抑制肿瘤细胞的肺转移且延长成瘤小鼠的生存期 | 第84-86页 |
| 3.9 总结与讨论 | 第86-89页 |
| 3.9.1 总结 | 第86-88页 |
| 3.9.2 讨论 | 第88-89页 |
| 3.10 实验展望 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-100页 |
| 缩略词表 | 第100-101页 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
