| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-21页 |
| 1.1 嵌合抗原受体的研究进展 | 第9-15页 |
| 1.1.1 嵌合抗原受体免疫治疗法概述 | 第9-10页 |
| 1.1.2 嵌合抗原受体的结构 | 第10-13页 |
| 1.1.2.1 细胞外结合区 | 第10-11页 |
| 1.1.2.2 铰链/间隔区 | 第11-12页 |
| 1.1.2.3 跨膜结构域 | 第12页 |
| 1.1.2.4 胞内信号转导结构域 | 第12-13页 |
| 1.1.3 嵌合抗原受体发展历程 | 第13-15页 |
| 1.1.4 嵌合抗原受体的应用前景 | 第15页 |
| 1.2 EGFRvⅢ的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.2.1 EGFR概述 | 第15-16页 |
| 1.2.2 EGFRvⅢ的结构与功能 | 第16-17页 |
| 1.2.3 EGFRvⅢ与肿瘤的相关性 | 第17-18页 |
| 1.2.3.1 EGFRvⅢ促进肿瘤细胞增殖的机制 | 第17页 |
| 1.2.3.2 EGFRvⅢ蛋白具有明显的致瘤能力 | 第17-18页 |
| 1.2.3.3 EGFRvⅢ促进肿瘤组织血管生成机制 | 第18页 |
| 1.2.3.4 EGFRvⅢ促进肿瘤侵袭迁移 | 第18页 |
| 1.3 慢病毒表达载体 | 第18-19页 |
| 1.4 本课题主要研究内容及创新之处 | 第19-21页 |
| 1.4.1 主要研究内容 | 第19-20页 |
| 1.4.2 本课题的特色与创新之处 | 第20-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-26页 |
| 2.1.1 菌株与细胞株: | 第21页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第22-24页 |
| 2.1.4 常用溶液配制 | 第24-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-43页 |
| 2.2.1 重组质粒pCDH-CMV-CAR-EF1-copGFP-T2A-Puro的构建 | 第26-32页 |
| 2.2.1.1 引物设计 | 第26页 |
| 2.2.1.2 重叠延伸基因拼接机制 | 第26-27页 |
| 2.2.1.3 EGFRvⅢsvFc基因和胞内段基因的PCR扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.1.4 重叠延伸基因拼接扩增融合基因 | 第28-29页 |
| 2.2.1.5 构建重组质粒 | 第29-32页 |
| 2.2.2 细胞培养 | 第32-33页 |
| 2.2.2.1 细胞复苏、传代培养及保种 | 第32-33页 |
| 2.2.2.2 细胞计数 | 第33页 |
| 2.2.3 重组质粒在细胞的表达 | 第33-36页 |
| 2.2.3.1 无内毒素质粒提取 | 第33页 |
| 2.2.3.2 重组质粒瞬时转染293T细胞 | 第33-36页 |
| 2.2.4 慢病毒的包装 | 第36-38页 |
| 2.2.4.1 辅助质粒无内毒素质粒的抽提 | 第36页 |
| 2.2.4.2 293T细胞的复苏与传代 | 第36-37页 |
| 2.2.4.3 非脂质体转染 | 第37页 |
| 2.2.4.4 慢病毒的浓缩 | 第37页 |
| 2.2.4.5 慢病毒滴度检测 | 第37-38页 |
| 2.2.5 病毒感染293T细胞及验证CAR蛋白的表达 | 第38-39页 |
| 2.2.5.1 慢病毒感染293T细胞 | 第38页 |
| 2.2.5.2 细胞总蛋白的提取 | 第38页 |
| 2.2.5.3 Western Blot验证CAR蛋白的表达 | 第38-39页 |
| 2.2.6 稳转Jurkat细胞株的筛选 | 第39-41页 |
| 2.2.6.1 嘌呤霉素杀灭曲线的确定 | 第39页 |
| 2.2.6.2 慢病毒感染Jurkat细胞 | 第39页 |
| 2.2.6.3 Puromycin抗性筛选Jurkat细胞 | 第39-40页 |
| 2.2.6.4 PCR鉴定单克隆细胞目的基因的整合 | 第40-41页 |
| 2.2.7 所筛选的Jurkat细胞株的增殖实验 | 第41-42页 |
| 2.2.8 所筛选的Jurkat细胞株IL-2分泌量的检测 | 第42-43页 |
| 第三章 结果分析 | 第43-54页 |
| 3.1 重组质粒pCDH-CMV-CAR-EF1-copGFP-T2A-Puro的构建 | 第43-45页 |
| 3.1.1 EGFRvⅢsvFc基因和胞内段基因的PCR扩增 | 第43-44页 |
| 3.1.2 重叠延伸基因拼接扩增融合基因 | 第44页 |
| 3.1.3 重组质粒双酶切验证 | 第44-45页 |
| 3.1.4 测序验证 | 第45页 |
| 3.2 重组质粒的表达 | 第45-47页 |
| 3.2.1 重组质粒转染293T细胞 | 第45-46页 |
| 3.2.2 Western Blot验证CAR蛋白在293T细胞的表达 | 第46-47页 |
| 3.3 慢病毒的包装、浓缩及滴度测定 | 第47-49页 |
| 3.3.1 慢病毒的包装 | 第47-48页 |
| 3.3.2 慢病毒的浓缩 | 第48页 |
| 3.3.3 慢病毒的滴度测定 | 第48-49页 |
| 3.4 慢病毒感染293T细胞Western Blot验证CAR的表达 | 第49页 |
| 3.5 慢病毒感染Jurkat细胞 | 第49-50页 |
| 3.6 Puromycin抗性筛选Jurkat细胞 | 第50-51页 |
| 3.7 PCR鉴定Jurkat单克隆细胞目的基因的整合 | 第51-52页 |
| 3.8 所筛选的Jurkat细胞株增殖实验 | 第52-53页 |
| 3.9 所筛选的Jurkat细胞株IL-2分泌量的检测 | 第53-54页 |
| 结论与展望 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 附录 | 第64-66页 |
| 个人简历 | 第66页 |
| 在校期间的研宄成果及发表的学术论文 | 第66页 |
