| 缩略词 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-16页 |
| 1 蛋白质药物长效化技术研究进展 | 第11-12页 |
| 1.1 蛋白质药物长效化主要措施 | 第11页 |
| 1.2 Fc融合蛋白载体研究进展 | 第11页 |
| 1.3 HSA融合蛋白载体研究进展 | 第11-12页 |
| 1.4 HSA第三结构域(HSA-D3)研究进展 | 第12页 |
| 2 蛋白表达系统研究进展 | 第12-13页 |
| 2.1 大肠杆菌表达系统 | 第12-13页 |
| 2.2 酵母表达系统 | 第13页 |
| 2.3 哺乳动物细胞表达系统 | 第13页 |
| 3 TMP模拟肽研究进展 | 第13-14页 |
| 3.1 TPO研究进展 | 第13-14页 |
| 3.2 本实验室TMP肽类模拟物前期研究 | 第14页 |
| 4 立题依据 | 第14-16页 |
| 第二章 TMP二联体之间连接肽及与HSA的连接方式对融合蛋白表达的影响 | 第16-22页 |
| 1 前言 | 第16页 |
| 2 材料与仪器 | 第16-17页 |
| 2.1 仪器 | 第16页 |
| 2.2 试剂 | 第16-17页 |
| 2.3 培养基及溶液配置 | 第17页 |
| 2.4 菌株 | 第17页 |
| 3 实验方法 | 第17-18页 |
| 3.1 蛋白表达 | 第17页 |
| 3.2 SDA-PAGE电泳分析 | 第17-18页 |
| 3.3 蛋白初纯化 | 第18页 |
| 3.4 蛋白定量 | 第18页 |
| 3.5 双荧光素酶法检测融合蛋白活性 | 第18页 |
| 4 结果与分析 | 第18-20页 |
| 4.1 蛋白原液SDS-PAGE电泳分析 | 第18-19页 |
| 4.2 纯化后样品SDS-PAGE电泳分析 | 第19-20页 |
| 4.3 双亮检测蛋白活性结果分析 | 第20页 |
| 5 结论与讨论 | 第20-22页 |
| 第三章 TMP二联体连接方式对融合蛋白表达的影响 | 第22-39页 |
| 1 引言 | 第22页 |
| 2 材料与仪器 | 第22-24页 |
| 2.1 主要仪器 | 第22页 |
| 2.2 试剂和材料 | 第22-24页 |
| 3 试验方法 | 第24-32页 |
| 3.1 实验流程图 | 第24页 |
| 3.2 表达载体构建 | 第24-31页 |
| 3.3 菌种保藏 | 第31页 |
| 3.4 转化质粒准备 | 第31页 |
| 3.5 酵母感受态制备 | 第31页 |
| 3.6 电激转化 | 第31-32页 |
| 3.7 克隆筛选 | 第32页 |
| 3.8 酵母蛋白表达及活性测定 | 第32页 |
| 4 实验结果 | 第32-38页 |
| 4.1 全基因合成片段酶切结果 | 第32-33页 |
| 4.2 PCR扩增产物结果 | 第33-34页 |
| 4.3 菌液PCR筛选结果 | 第34页 |
| 4.4 重组克隆酶切鉴定结果 | 第34-35页 |
| 4.5 重组质粒图谱 | 第35页 |
| 4.6 质粒提取及线性化结果 | 第35-36页 |
| 4.7 目的蛋白SDS-PAGE鉴定结果 | 第36-38页 |
| 4.8 双荧光素酶检测融合蛋白活性 | 第38页 |
| 5 结论与讨论 | 第38-39页 |
| 第四章 HSA-D3对TMP融合蛋白表达的影响 | 第39-57页 |
| 1 引言 | 第39页 |
| 2 主要仪器和试剂 | 第39-40页 |
| 2.1 细菌菌种 | 第39页 |
| 2.2 质粒载体 | 第39页 |
| 2.3 分子生物学试剂 | 第39-40页 |
| 2.4 培养基和溶液配置 | 第40页 |
| 2.5 其他仪器和试剂 | 第40页 |
| 3 实验方法 | 第40-47页 |
| 3.1 实验流程图 | 第40页 |
| 3.2 表达载体构建 | 第40-46页 |
| 3.3 转化质粒准备 | 第46-47页 |
| 3.4 酵母感受态制备 | 第47页 |
| 3.5 电激转化毕赤酵母 | 第47页 |
| 3.6 克隆筛选 | 第47页 |
| 3.7 蛋白表达及活性测定 | 第47页 |
| 4 实验结果与分析 | 第47-55页 |
| 4.1 PCR结果 | 第47-48页 |
| 4.2 菌液PCR筛选结果 | 第48页 |
| 4.3 酶切鉴定结果 | 第48-49页 |
| 4.4 重组克隆载体图谱 | 第49页 |
| 4.5 重组质粒线性化 | 第49-50页 |
| 4.6 蛋白表达结果 | 第50-51页 |
| 4.7 融合蛋白活双荧光素酶活性检测结果 | 第51-55页 |
| 5 结论与讨论 | 第55-57页 |
| 第五章 CHO表达系统对TMP融合蛋白表达的影响 | 第57-82页 |
| 1 引言 | 第57页 |
| 2 实验材料和器材 | 第57-58页 |
| 2.1 主要仪器 | 第57页 |
| 2.2 分子生物学相关试剂 | 第57页 |
| 2.3 细菌菌种 | 第57-58页 |
| 2.4 质粒载体 | 第58页 |
| 2.5 培养基和溶液配置 | 第58页 |
| 3 实验方法 | 第58-76页 |
| 3.1 试验流程图 | 第58页 |
| 3.2 TMP-HSA-HIS哺乳动物细胞瞬时转染载体构建 | 第58-62页 |
| 3.3 TMP-HSA稳定转染单位点载体构建 | 第62-65页 |
| 3.4 TMP-HSA双位点稳定转染载体构建 | 第65-68页 |
| 3.5 HSA-TMP单位点稳定转染载体构建 | 第68-72页 |
| 3.6 HSA-TMP双位点稳定转染载体构建构建 | 第72-76页 |
| 3.7 蛋白活性检测 | 第76页 |
| 4 实验结果 | 第76-80页 |
| 4.1 目的片段准备结果 | 第76-77页 |
| 4.2 菌液PCR筛选结果 | 第77页 |
| 4.3 重组载体酶切鉴定结果 | 第77-78页 |
| 4.4 目的基因组成图谱 | 第78-79页 |
| 4.5 SDA-PAGE电泳分析 | 第79页 |
| 4.6 融合蛋白双荧光素酶检测活性结果 | 第79-80页 |
| 5 结论与讨论 | 第80-82页 |
| 第六章 全文总结 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-87页 |
| 在研期间研究成果 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88页 |