| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 前言 | 第11-25页 |
| 1.1 变温动物抗冷的研究现状 | 第11-17页 |
| 1.1.1 低温对变温动物的影响 | 第11-12页 |
| 1.1.2 抗冷机制的研究 | 第12-17页 |
| 1.1.2.1 用产热的方式来应对冷应激 | 第12-13页 |
| 1.1.2.2 通过离子梯度的修复获得冷耐受 | 第13-14页 |
| 1.1.2.3 通过代谢产物获得冷耐受 | 第14-16页 |
| 1.1.2.4 通过细胞膜结构的调整和膜成分的改变 | 第16-17页 |
| 1.2 cAMP/PKA信号通路概述 | 第17-20页 |
| 1.2.1 G蛋白 | 第17-18页 |
| 1.2.2 蛋白激酶A | 第18-19页 |
| 1.2.3 cAMP/PKA信号通路与冷耐受的关系 | 第19-20页 |
| 1.3 秀丽隐杆线虫冷耐受的研究现状 | 第20-23页 |
| 1.3.1 秀丽隐杆线虫 | 第20-21页 |
| 1.3.2 秀丽隐杆线虫冷耐受的研究现状 | 第21-23页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第23-25页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第25-55页 |
| 2.1 实验材料和仪器 | 第25-29页 |
| 2.1.1 实验线虫菌株和质粒 | 第25-26页 |
| 2.1.2 主要的化学试剂和培养基 | 第26-28页 |
| 2.1.2.1 化学试剂 | 第26页 |
| 2.1.2.2 实验中使用的培养基及溶液 | 第26-28页 |
| 2.1.3 主要实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.2. 实验方法 | 第29-55页 |
| 2.2.1 秀丽隐杆线虫的培养 | 第29-30页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌E.coli OP50的活化与培养 | 第29-30页 |
| 2.2.1.2 NGM培养基平板的制备 | 第30页 |
| 2.2.1.3 线虫的接种 | 第30页 |
| 2.2.1.4 线虫的冻存与复苏 | 第30页 |
| 2.2.2 线虫的同步化 | 第30-31页 |
| 2.2.3 秀丽隐杆线虫中RNA干扰实验 | 第31-32页 |
| 2.2.4 线虫基因组的提取 | 第32-34页 |
| 2.2.5 线虫中RNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.5.1 RNA的提取操作步骤 | 第34页 |
| 2.2.5.2 RNA的完整性及浓度检测 | 第34-35页 |
| 2.2.6 cDNA的制备 | 第35页 |
| 2.2.7 线虫过表达体的构建 | 第35-42页 |
| 2.2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.7.2 质粒转化 | 第36页 |
| 2.2.7.3 质粒的提取 | 第36-38页 |
| 2.2.7.4 目的基因片段的扩增 | 第38-39页 |
| 2.2.7.5 扩增产物的检测和回收 | 第39-40页 |
| 2.2.7.6 回收的扩增产物与载体的双酶切反应 | 第40-41页 |
| 2.2.7.7 与载体的连接 | 第41页 |
| 2.2.7.8 重组质粒的转化 | 第41页 |
| 2.2.7.9 重组质粒转化子的筛选和鉴定 | 第41页 |
| 2.2.7.10 重组质粒的提取、酶切及测序 | 第41-42页 |
| 2.2.7.11 线虫的显微注射 | 第42页 |
| 2.2.8 线虫的冷耐受分析 | 第42-43页 |
| 2.2.9 cAMP水平的测定 | 第43-44页 |
| 2.2.9.1 BCA法测定蛋白浓度 | 第43-44页 |
| 2.2.9.2 cAMP水平的测定 | 第44页 |
| 2.2.10 线虫GFP的荧光分析 | 第44-45页 |
| 2.2.11 线虫杂交实验 | 第45-46页 |
| 2.2.12 rel-time PCR分析 | 第46-47页 |
| 2.2.13 尼罗红染色 | 第47页 |
| 2.2.14 油红O染色 | 第47-48页 |
| 2.2.14.1 油红O染色的染色方法 | 第47-48页 |
| 2.2.14.2 油红O的定量 | 第48页 |
| 2.2.15 三脂酰甘油的定量分析 | 第48-49页 |
| 2.2.16 甘油的测定 | 第49-50页 |
| 2.2.16.1 蛋白质浓度定量 | 第49页 |
| 2.2.16.2 甘油水平的测定 | 第49-50页 |
| 2.2.17 线虫的脱水分析 | 第50-51页 |
| 2.2.18 蛋白免疫应迹 | 第51-54页 |
| 2.2.18.1 线虫蛋白的提取 | 第51页 |
| 2.2.18.2 蛋白含量测定 | 第51页 |
| 2.2.18.3 蛋白样品处理 | 第51-52页 |
| 2.2.18.4 Western blot杂交步骤 | 第52-53页 |
| 2.2.18.5 关于磷酸化蛋白检测的注意事项 | 第53-54页 |
| 2.2.19 统计学分析 | 第54-55页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第55-83页 |
| 3.1 cAMP-PKA信号通路正调控秀丽隐杆线虫的冷耐受 | 第55-60页 |
| 3.2 在冷应激下,PKA/KIN-1动员线虫体内的脂肪水解 | 第60-63页 |
| 3.3 线虫在冷应激下的脂肪水解和冷耐受需要HOSL-1的参与 | 第63-71页 |
| 3.4 KIN-1调节的脂肪水解需要HOSL-1的参与 | 第71-74页 |
| 3.5 在冷应激下,KIN-1/HOSL-1调节甘油的产生,并且甘油对线虫的冷耐是必需的 | 第74-76页 |
| 3.6 KIN-1调控的水通道蛋白能够调节秀丽隐杆线虫的冷耐受 | 第76-78页 |
| 3.7 PKA作用于秀丽隐杆线虫的神经元和肠道来调节其冷耐受 | 第78-83页 |
| 第四章 讨论 | 第83-87页 |
| 第五章 总结及展望 | 第87-90页 |
| 附表Ⅰ 用于荧光定量PCR的引物 | 第90-93页 |
| 附表Ⅱ 利用荧光定量PCR检测的RNAi效率 | 第93-95页 |
| 附表Ⅲ 在20℃和4℃生长的线虫其体内脂肪酸的组成(%) | 第95-98页 |
| 附表Ⅳ pPD95.75质粒图谱 | 第98-99页 |
| 附表Ⅴ 英文缩略表 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-110页 |
| 读博士期间(待)发表、撰写的学术论文 | 第110页 |
| 参加的学术会议及发表的会议摘要 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
