| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-24页 |
| 1.1 禽白血病 J 亚群研究现状 | 第14-17页 |
| 1.1.1 ALV-J 分子病毒学特性 | 第14页 |
| 1.1.2 ALV-J 基因组学 | 第14-15页 |
| 1.1.3 ALV-J 的流行病学 | 第15-16页 |
| 1.1.4 ALV-J 的致病性及危害 | 第16-17页 |
| 1.1.5 ALV-J 的防控 | 第17页 |
| 1.2 ALV-J 的检测方法 | 第17-20页 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 | 第17-18页 |
| 1.2.2 免疫学检测方法 | 第18-19页 |
| 1.2.3 核酸分子检测方法 | 第19-20页 |
| 1.3 ELISA 检测技术 | 第20-22页 |
| 1.3.1 双抗原夹心法测抗体 | 第21页 |
| 1.3.2 双抗体夹心法测抗原 | 第21页 |
| 1.3.3 间接法测抗体 | 第21页 |
| 1.3.4 竞争法测抗体 | 第21-22页 |
| 1.4 胶体金试纸条检测技术 | 第22页 |
| 1.4.1 胶体金技术的原理 | 第22页 |
| 1.4.2 胶体金的制备 | 第22页 |
| 1.5 本课题研究的目的和意义 | 第22-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-39页 |
| 2.1 材料 | 第24-25页 |
| 2.1.1 实验细胞和动物 | 第24页 |
| 2.1.2 试验用菌种、病毒和载体质粒 | 第24页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第24页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.5 实验地点 | 第25页 |
| 2.2 目的蛋白原核表达体系的建立 | 第25-29页 |
| 2.2.1 病毒 DNA 的获取 | 第25页 |
| 2.2.2 引物设计与合成 | 第25页 |
| 2.2.3 目的基因的获取 | 第25-26页 |
| 2.2.4 DH5α感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.2.5 连接产物的转化 | 第26页 |
| 2.2.6 重组质粒 pET-30a-gp85 的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.2.7 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第27页 |
| 2.2.8 包涵体的提取与复性 | 第27-28页 |
| 2.2.9 纯化蛋白的 Western Blot 检测 | 第28-29页 |
| 2.3 间接 ELISA 检测抗体方法的建立 | 第29-31页 |
| 2.3.1 间接 ELISA 方法检测抗体的常规步骤 | 第29页 |
| 2.3.2 间接 ELISA 条件的优化 | 第29-31页 |
| 2.3.3 间接 ELISA 方法特异性检测 | 第31页 |
| 2.3.4 间接 ELISA 方法重复性检测 | 第31页 |
| 2.3.5 本 ELISA 检测方法与 IDEXX 商品化试剂盒的比较 | 第31页 |
| 2.3.6 间接 ELISA 检测方法的临床应用 | 第31页 |
| 2.4 ALV-J 夹心 ELISA 抗原检测方法的建立 | 第31-35页 |
| 2.4.1 ALV-J His-gp85 蛋白多克隆抗体 | 第31页 |
| 2.4.2 多克隆抗体效价的测定 | 第31-32页 |
| 2.4.3 ALV-J His-gp85 蛋白单克隆抗体的制备 | 第32-34页 |
| 2.4.4 夹心 ELISA 方法的建立 | 第34-35页 |
| 2.5 胶体金检测抗体方法的建立 | 第35-39页 |
| 2.5.1 胶体金颗粒制备 | 第35页 |
| 2.5.2 免疫胶体金标记最适 pH 值的测定 | 第35-36页 |
| 2.5.3 免疫胶体金标记最佳蛋白浓度的确定 | 第36页 |
| 2.5.4 抗原封闭剂浓度确定 | 第36-37页 |
| 2.5.5 免疫胶体金标记 | 第37页 |
| 2.5.6 免疫胶体金抗原抗体最佳包被浓度的确定 | 第37页 |
| 2.5.7 免疫胶体金试纸条的组装 | 第37页 |
| 2.5.8 结果判定 | 第37-38页 |
| 2.5.9 符合性试验 | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-53页 |
| 3.1 目的蛋白原核表达体系的建立 | 第39-42页 |
| 3.1.1 病毒检测 | 第39页 |
| 3.1.2 PCR 扩增 ALV-J gp85 基因 | 第39页 |
| 3.1.3 pET30a-gp85 重组质粒的酶切鉴定 | 第39-40页 |
| 3.1.4 gp85 基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第40页 |
| 3.1.5 纯化后目的蛋白的 SDS-PAGE 检测 | 第40-41页 |
| 3.1.6 纯化后的蛋白进行 Western Blot 检测 | 第41-42页 |
| 3.2 间接 ELISA 方法的建立 | 第42-47页 |
| 3.2.1 ELISA 条件优化结果 | 第42-46页 |
| 3.2.2 ELISA 与 IDEXX 试剂盒检测结果比较 | 第46-47页 |
| 3.2.3 临床样本的检测 | 第47页 |
| 3.3 ALV-J 夹心 ELISA 抗原检测方法的建立 | 第47-50页 |
| 3.3.1 ALV-J gp85 蛋白多克隆抗体效价的测定 | 第47页 |
| 3.3.2 ALV-J gp85 蛋白免疫小鼠效价测定 | 第47-48页 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞株的筛选 | 第48页 |
| 3.3.4 单克隆抗体的 IFA 鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.5 包被抗体和第二抗体最佳浓度测定 | 第49页 |
| 3.3.6 临界值的确定 | 第49-50页 |
| 3.3.7 临床样本检测 | 第50页 |
| 3.4 免疫胶体金试纸条制备 | 第50-53页 |
| 3.4.1 免疫胶体金标最适标记 pH 值测定 | 第50页 |
| 3.4.2 免疫胶体金标记最佳蛋白浓度测定 | 第50-51页 |
| 3.4.3 标记蛋白封闭剂浓度的确定 | 第51页 |
| 3.4.4 抗原抗体包被浓度的确定 | 第51-52页 |
| 3.4.5 符合性实验 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 5 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 作者简介及攻读硕士学位期间发表论文 | 第64页 |
