| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 前言 | 第13-22页 |
| 1.1 流行病学 | 第13-14页 |
| 1.2 猪流行性腹泻病毒感染研究概况 | 第14-18页 |
| 1.2.1 猪流行性腹泻及其分子生物学特性 | 第14-18页 |
| 1.3 猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展 | 第18-20页 |
| 1.3.1 免疫电镜法 | 第18页 |
| 1.3.2 免疫荧光法 | 第18-19页 |
| 1.3.3 微量血清中和试验 | 第19页 |
| 1.3.4 ELISA方法 | 第19页 |
| 1.3.5 RT-LAMP技术 | 第19页 |
| 1.3.6 RT-PCR检测法 | 第19-20页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第20-22页 |
| 第二章 PEDV、TGEV、PDCOV三重RT-PCR检测方法的建立 | 第22-36页 |
| 1 材料与方法 | 第22-28页 |
| 1.1 病毒和毒株 | 第22页 |
| 1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 1.3 主要仪器 | 第22-23页 |
| 1.4 常用试剂和培养基配制 | 第23页 |
| 1.5 引物的设计与合成 | 第23-24页 |
| 1.6 样品及模板的制备 | 第24-25页 |
| 1.6.1 PEDV RNA的抽提 | 第24页 |
| 1.6.2 反转录体系 | 第24-25页 |
| 1.7 常规RT-PCR扩增 | 第25-26页 |
| 1.7.1 常规PCR反应体系的初步建立 | 第25-26页 |
| 1.8 多重PCR检测方法的建立及条件优化 | 第26-28页 |
| 1.8.1 多重PCR条件的优化 | 第26-27页 |
| 1.8.2 特异性试验 | 第27页 |
| 1.8.3 敏感性试验 | 第27页 |
| 1.8.4 多重RT-PCR临床检测及与常规RT-PCR的比较 | 第27-28页 |
| 2 结果 | 第28-33页 |
| 2.1 单重PCR条件的确定 | 第28页 |
| 2.2 多重PCR条件的摸索 | 第28-29页 |
| 2.2.1 退火温度 | 第28-29页 |
| 2.2.2 引物浓度 | 第29页 |
| 2.3 多重RT-PCR特异性检测结果 | 第29-31页 |
| 2.4 多重RT-PCR敏感性检测结果 | 第31-32页 |
| 2.5 多重RT-PCR临床检测和单重RT-PCR的比较结果 | 第32-33页 |
| 3 小结与讨论 | 第33-36页 |
| 第三章 猪流性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立 | 第36-45页 |
| 1 材料与方法 | 第36-39页 |
| 1.1 毒株及细胞 | 第36页 |
| 1.2 主要试剂 | 第36页 |
| 1.3 主要仪器 | 第36-37页 |
| 1.4 常用试剂和培养基配制 | 第37页 |
| 1.5 引物的设计与合成 | 第37页 |
| 1.6 RNA的抽提与CDNA的合成 | 第37-38页 |
| 1.6.1 RNA抽提 | 第37-38页 |
| 1.6.2 CDNA的合成 | 第38页 |
| 1.7 操作方法 | 第38-39页 |
| 1.7.1 第一轮反应 | 第38-39页 |
| 1.7.2 第二轮反应 | 第39页 |
| 1.8 特异性试验 | 第39页 |
| 1.9 灵敏性试验 | 第39页 |
| 1.10 RT-NESTED PCR的初步应用 | 第39页 |
| 2 结果 | 第39-43页 |
| 2.1 套式RT-PCR的结果 | 第39-40页 |
| 2.2 特异性检验 | 第40-42页 |
| 2.3 灵敏性试验 | 第42页 |
| 2.4 RT-NESTED PCR的初步应用结果 | 第42-43页 |
| 3 讨论与小结 | 第43-45页 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒ORF3和COE全基因序列测定及分析 | 第45-60页 |
| 1 材料与方法 | 第45-52页 |
| 1.1 病毒 | 第45页 |
| 1.2 主要试剂 | 第45页 |
| 1.3 主要仪器 | 第45页 |
| 1.4 常用试剂和培养基配制 | 第45页 |
| 1.5 引物的设计与合成 | 第45页 |
| 1.6 参考毒株 | 第45-46页 |
| 1.7 病料的鉴定 | 第46-52页 |
| 1.7.1 PEDV RNA的抽提 | 第46-47页 |
| 1.7.2 CDNA的合成 | 第47页 |
| 1.7.3 ORF3和COE基因的扩增 | 第47-49页 |
| 1.7.4 目的片段产物的纯化回收 | 第49页 |
| 1.7.5 回收纯化的DNA产物连接PMD18-T载体 | 第49-50页 |
| 1.7.6 大肠杆菌DH5Α感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 1.7.7 连接产物转化DH5Α 感受态细胞 | 第50页 |
| 1.7.8 重组质粒的鉴定 | 第50-51页 |
| 1.7.9 ORF3和COE基因序列测定、分析和比较 | 第51-52页 |
| 2 结果 | 第52-58页 |
| 2.1 PEDV ORF3和COE全基因RT-PCR扩增结果 | 第52页 |
| 2.2 菌液PCR检测和序列分析结果 | 第52-58页 |
| 3 讨论与小结 | 第58-60页 |
| 全文总结 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
