| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第12-27页 |
| 1.1 淀粉概述 | 第12-13页 |
| 1.2 淀粉酶简介 | 第13页 |
| 1.3 淀粉酶的来源 | 第13-14页 |
| 1.4 淀粉酶的分类 | 第14-15页 |
| 1.5 α-淀粉酶 | 第15-17页 |
| 1.5.1 α-淀粉酶的特点 | 第15页 |
| 1.5.2 α-淀粉酶的空间结构 | 第15页 |
| 1.5.3 α-淀粉酶的理化性质 | 第15-17页 |
| 1.5.4 α-淀粉酶的应用 | 第17页 |
| 1.6 嗜盐微生物 | 第17-20页 |
| 1.6.1 嗜盐微生物简介 | 第17-18页 |
| 1.6.2 嗜盐微生物的分类 | 第18页 |
| 1.6.3 嗜盐微生物的嗜盐机理 | 第18-20页 |
| 1.7 嗜盐酶 | 第20-23页 |
| 1.7.1 嗜盐酶概述 | 第20-21页 |
| 1.7.2 嗜盐酶应用 | 第21-22页 |
| 1.7.3 嗜盐酶盐适应性的机理研究 | 第22-23页 |
| 1.8 蛋白质分子改造 | 第23-25页 |
| 1.8.1 易错PCR | 第24页 |
| 1.8.2 定点突变 | 第24-25页 |
| 1.9 课题研究依据及意义 | 第25-26页 |
| 1.10 有关技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第27页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第27页 |
| 2.1.3 主要酶制剂 | 第27页 |
| 2.1.4 各种常用培养基及其溶液的配置 | 第27页 |
| 2.1.5 主要的仪器设备 | 第27页 |
| 2.2 实验的具体方法和步骤 | 第27-37页 |
| 2.2.1 细菌总DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.2 质粒提取方法 | 第28页 |
| 2.2.3 感受态细胞的制备 | 第28页 |
| 2.2.4 重组质粒的连接构建 | 第28-29页 |
| 2.2.5 重组质粒的转化 | 第29页 |
| 2.2.6 信号肽预测 | 第29-30页 |
| 2.2.7 引物的设计 | 第30-31页 |
| 2.2.8 PCR扩增 | 第31页 |
| 2.2.9 重组质粒的验证 | 第31-32页 |
| 2.2.10 重组淀粉酶基因的诱导表达 | 第32页 |
| 2.2.11 重组淀粉酶目的蛋白的纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.12 镍柱亲和层析纯化目的蛋白具体操作步骤如下 | 第33页 |
| 2.2.13 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 | 第33页 |
| 2.2.14 标准曲线的测定 | 第33-35页 |
| 2.2.15 DNS法测定产还原糖淀粉酶酶活原理 | 第35-36页 |
| 2.2.16 淀粉酶酶活测定 | 第36页 |
| 2.2.17 酶学特性研究 | 第36页 |
| 2.2.18 HPLC对淀粉酶水解产物的分析条件 | 第36页 |
| 2.2.19 同源建模及其定点突变位点的选择 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与分析 | 第37-65页 |
| 3.1 根癌农杆菌EHA1252基因序列分析 | 第37-38页 |
| 3.1.1 信号肽的预测 | 第37-38页 |
| 3.2 根癌农杆菌EHA1252总DNA的提取 | 第38-39页 |
| 3.3 根癌农杆菌EHA1252基因的克隆 | 第39页 |
| 3.4 根癌农杆菌EHA1252重组质粒验证 | 第39-40页 |
| 3.4.1 重组质粒双酶切验证 | 第39-40页 |
| 3.4.2 重组质粒测序验证 | 第40页 |
| 3.5 根癌农杆菌EHA1252重组酶嗜盐性质的鉴定 | 第40-41页 |
| 3.6 重组酶pSE380-EHA1252蛋白表达及其纯化 | 第41页 |
| 3.7 根癌农杆菌EHA1252相关嗜盐性质的研究 | 第41-49页 |
| 3.7.1 重组酶在不同盐溶液条件下的酶活 | 第41-42页 |
| 3.7.2 重组酶在不同缓冲液环境下的酶活 | 第42-43页 |
| 3.7.3 在有NaCl存在时的最适pH | 第43页 |
| 3.7.4 重组酶的最适温度 | 第43-44页 |
| 3.7.5 重组酶的最适NaCl浓度 | 第44页 |
| 3.7.6 重组酶的pH稳定性 | 第44-45页 |
| 3.7.7 重组酶的热稳定性 | 第45-46页 |
| 3.7.8 Ca~(2+)对重组酶活影响 | 第46页 |
| 3.7.9 EDTA对重组酶活性的影响 | 第46-47页 |
| 3.7.10 不同金属离子对重组酶活性的影响 | 第47页 |
| 3.7.11 不同有机溶剂对重组酶活性的影响 | 第47-48页 |
| 3.7.12 HPLC对重组酶EHA1252水解产物的检测分析 | 第48页 |
| 3.7.13 重组酶EHA1252的比活力测定 | 第48-49页 |
| 3.7.14 重组酶EHA1252的K_m、V_(max)值的测定 | 第49页 |
| 3.8 不同来源嗜盐α-淀粉酶比对分析 | 第49-50页 |
| 3.8.1 DNA和氨基酸的比对分析 | 第49-50页 |
| 3.9 对本文所研究的嗜盐酶基因进行进化树的分析 | 第50-51页 |
| 3.10 不同来源的嗜盐α-淀粉酶酶学性质的比对 | 第51-52页 |
| 3.11 嗜盐α-淀粉酶嗜盐相关的氨基酸残基研究 | 第52页 |
| 3.11.1 研究材料的选择 | 第52页 |
| 3.11.2 K6定点突变位点的选择 | 第52页 |
| 3.12 嗜盐淀粉酶点突变基因K6-N204D、K6-P368G的克隆 | 第52-53页 |
| 3.13 K6点突变重组质粒验证 | 第53-54页 |
| 3.13.1 重组质粒双酶切验证 | 第53-54页 |
| 3.13.2 重组质粒测序验证 | 第54页 |
| 3.14 嗜盐淀粉酶K6点突变蛋白表达及其纯化 | 第54-55页 |
| 3.15 突变酶K6-N204D、K6-P368G的酶学性质研究 | 第55-65页 |
| 3.15.1 嗜盐淀粉酶在不同盐溶液条件下的酶活 | 第55页 |
| 3.15.2 嗜盐淀粉酶在不同缓冲液环境下的酶活 | 第55-56页 |
| 3.15.3 突变型嗜盐淀粉酶K6的最适pH | 第56-57页 |
| 3.15.4 突变型嗜盐淀粉酶K6的最适温度 | 第57-58页 |
| 3.15.5 突变型嗜盐淀粉酶K6的最适NaCl浓度 | 第58-59页 |
| 3.15.6 突变型嗜盐淀粉酶K6的pH稳定性 | 第59页 |
| 3.15.7 突变型嗜盐淀粉酶K6的热稳定性 | 第59-60页 |
| 3.15.8 Ca~(2+)对突变型嗜盐淀粉酶k6的酶活影响 | 第60页 |
| 3.15.9 EDTA对突变型嗜盐淀粉酶K6的酶活影响 | 第60-61页 |
| 3.15.10 不同金属离子对突变型嗜盐淀粉酶K6的酶活影响 | 第61-62页 |
| 3.15.11 有机溶剂对突变型嗜盐淀粉酶k6的酶活影响 | 第62页 |
| 3.15.12 NaCl对非嗜盐α-淀粉酶活力的影响 | 第62-63页 |
| 3.15.13 HPLC对突变型嗜盐淀粉酶K6-N204D、K6-P368G水解产物的检测分析 | 第63页 |
| 3.15.14 突变酶K6-N204D、K6-P368G比活力测定 | 第63页 |
| 3.15.15 突变酶K6-N204D、K6-P368G的K_m、V_(max)测定 | 第63-65页 |
| 第四章 讨论 | 第65-67页 |
| 4.1 嗜盐淀粉酶 | 第65-66页 |
| 4.2 嗜盐酶盐适应性机理 | 第66-67页 |
| 第五章 结论与展望 | 第67-69页 |
| 5.1 结论 | 第67-68页 |
| 5.2 展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-79页 |
| 附录1 | 第79-82页 |
| 附录2 | 第82-86页 |
| 附录3 | 第86-87页 |
| 附录4 | 第87-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第90页 |
