| 论文创新点 | 第5-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第—章 猪瘟病毒分子生物学 | 第14-44页 |
| 1.1 概述 | 第14页 |
| 1.2 猪瘟病毒及其基因组结构与功能 | 第14-29页 |
| 1.2.1 分类 | 第15页 |
| 1.2.2 基因组结构 | 第15-17页 |
| 1.2.3 猪瘟病毒的生命周期 | 第17-20页 |
| 1.2.4 猪瘟病毒编码的蛋白 | 第20-29页 |
| 1.3 瘟病毒NS2蛋白的功能 | 第29-32页 |
| 1.3.1 NS2蛋白的亚细胞定位 | 第29-30页 |
| 1.3.2 NS2-3前体蛋白的切割及对病毒特性的影响 | 第30-32页 |
| 1.3.3 NS2与感染性病毒产生 | 第32页 |
| 1.4 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2的结构与功能 | 第32-37页 |
| 1.4.1 HCV NS2 N端跨膜区 | 第33页 |
| 1.4.2 HCV NS2~(pro)的晶体结构 | 第33-34页 |
| 1.4.3 HCV NS2与病毒RNA复制 | 第34-35页 |
| 1.4.4 HCV NS2与病毒的组装和释放 | 第35-37页 |
| 1.5 猪瘟病毒生物学特性 | 第37-40页 |
| 1.5.1 致细胞病变效应 | 第37-38页 |
| 1.5.2 病毒感染与先天免疫 | 第38-39页 |
| 1.5.3 病毒毒力 | 第39-40页 |
| 1.6 猪瘟病毒反向遗传操作技术研究 | 第40-43页 |
| 1.7 本论文研究目的和意义 | 第43-44页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第44-73页 |
| 2.1 实验材料 | 第44-48页 |
| 2.1.1 菌株、质粒、细胞和病毒 | 第44页 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 | 第44-45页 |
| 2.1.3 常规试剂、工具酶、试剂盒、抗体和培养基 | 第45-46页 |
| 2.1.4 常用溶液的配制 | 第46-48页 |
| 2.2 实验方法 | 第48-73页 |
| 2.2.1 PCR扩增目的片段 | 第48页 |
| 2.2.2 DNA目的片段的回收 | 第48-49页 |
| 2.2.3 目的片段与载体的酶切、连接 | 第49页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第49-50页 |
| 2.2.5 阳性菌落的鉴定及质粒提取 | 第50-51页 |
| 2.2.6 PK-15细胞基因组DNA提取 | 第51-52页 |
| 2.2.7 重组质粒的构建 | 第52-63页 |
| 2.2.8 基因组RNA体外转录 | 第63页 |
| 2.2.9 细胞的复苏、传代及冻存 | 第63-64页 |
| 2.2.10 cDNA或RNA的转染 | 第64-65页 |
| 2.2.11 总RNA和病毒RNA提取 | 第65-66页 |
| 2.2.12 间接免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA) | 第66页 |
| 2.2.13 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第66-67页 |
| 2.2.14 病毒滴度测定(TCID_(50)/mL) | 第67页 |
| 2.2.15 免疫蚀斑实验 | 第67页 |
| 2.2.16 荧光素酶活性实验 | 第67-68页 |
| 2.2.17 实时定量RT-PCR(Quantitative real-time RT-PCR qRT-PCR) | 第68页 |
| 2.2.18 蛋白免疫印记(Western blot) | 第68-69页 |
| 2.2.19 免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP) | 第69-70页 |
| 2.2.20 cDNA 5'末端的快速扩增(5'-rapid amplification of cDNA end,5 '-RACE)和3'末端的快速扩增(3'-RACE) | 第70-73页 |
| 第三章 —种高效拯救猪瘟病毒新型反向遗传操作技术的建立 | 第73-85页 |
| 3.1 实验结果 | 第73-82页 |
| 3.1.1 基于RNA聚合酶Ⅰ启动子的CSFV石门株cDNA克隆pSPT_I/SM的构建 | 第74-76页 |
| 3.1.2 基于cDNA克隆pSPT_I/SM的CSFV拯救与鉴定 | 第76-78页 |
| 3.1.3 vSPT_I/SM的特性 | 第78-79页 |
| 3.1.4 vSPT_I/SM末端序列分析 | 第79-80页 |
| 3.1.5 基于RNA聚合酶Ⅰ系统反向遗传操作技术拯救猪瘟疫苗C株病毒 | 第80-82页 |
| 3.2 讨论 | 第82-85页 |
| 第四章 非编码区对猪瘟病毒复制的调节作用 | 第85-94页 |
| 4.1 实验结果 | 第86-92页 |
| 4.1.1 CSFV强毒石门株非编码区替换猪瘟疫苗C株重组质粒的构建 | 第86-87页 |
| 4.1.2 非编码区替换的猪瘟疫苗C株重组嵌合病毒的拯救及特性 | 第87-90页 |
| 4.1.3 猪瘟疫苗C株嵌合突变体病毒在细胞上传代的遗传稳定性 | 第90-92页 |
| 4.2 讨论 | 第92-94页 |
| 第五章 非结构蛋白NS2在猪瘟病毒复制中的调控作用及机制 | 第94-115页 |
| 5.1 实验结果 | 第95-112页 |
| 5.1.1 CSFV NS2蛋白拓扑结构与N端跨膜区氨基酸序列 | 第95-97页 |
| 5.1.2 NS2单点突变全长cDNA感染性克隆的构建 | 第97-98页 |
| 5.1.3 NS2 N端影响感染性病毒产生的关键氨基酸位点 | 第98-99页 |
| 5.1.4 NS2 N端氨基酸突变对病毒基因组RNA复制的调节 | 第99-103页 |
| 5.1.5 NS2 N端氨基酸突变对NS2-3前体蛋白加工效率和NS2-NS2相互作用的影响 | 第103-106页 |
| 5.1.6 NS2 N端氨基酸调控基因组复制不依赖NS2-3的切割 | 第106-110页 |
| 5.1.7 NS2 N端氨基酸致死突变体的回复及NS2/R100A补偿突变位点NS2/I90L的证实 | 第110-112页 |
| 5.2 讨论 | 第112-115页 |
| 研究总结 | 第115-117页 |
| 参考文献 | 第117-130页 |
| 攻博期间发表与待发表的文章 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131页 |
