| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩写说明 | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第16-31页 |
| 1.1 肥胖的流行与危害 | 第16页 |
| 1.2 体重调节与肥胖发生机制的研究进展 | 第16-22页 |
| 1.2.1 体重的影响因素 | 第16-17页 |
| 1.2.2 进化思想与“节俭基因”假说 | 第17页 |
| 1.2.3 “能量稳态”假说与争议 | 第17-20页 |
| 1.2.4 肠道菌群与肥胖 | 第20-21页 |
| 1.2.5 肥胖研究的其他观点 | 第21-22页 |
| 1.3 Rcan2基因与体重调节 | 第22-26页 |
| 1.3.1 Rcan2基因的发现与简介 | 第22-24页 |
| 1.3.2 Rcan2基因的功能 | 第24-26页 |
| 1.3.2.1 Rcan2~(-/-)小鼠模型 | 第24页 |
| 1.3.2.2 Rcan2在体重调节和肥胖发生中的功能研究 | 第24-26页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9与基因组编辑 | 第26-29页 |
| 1.4.1 基因组编辑技术的沿革 | 第26-27页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas系统 | 第27-28页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9系统的改造与基因组编辑 | 第28-29页 |
| 1.5 Tol2转座子系统与转基因动物模型的建立 | 第29-31页 |
| 1.5.1 Tol2转座子简介 | 第29-30页 |
| 1.5.2 Tol2转座子系统的改造及其在转基因动物模型中的应用 | 第30-31页 |
| 2 实验动物、试剂与仪器 | 第31-40页 |
| 2.1 实验动物 | 第31页 |
| 2.2 实验所需试剂 | 第31-37页 |
| 2.2.1 主要试剂及其配制方法 | 第31-35页 |
| 2.2.2 其他试剂 | 第35-37页 |
| 2.3 实验耗材与仪器 | 第37-40页 |
| 2.3.1 动物饲料 | 第37页 |
| 2.3.2 实验耗材 | 第37页 |
| 2.3.3 主要实验仪器 | 第37-40页 |
| 3 实验方法 | 第40-68页 |
| 3.1 实验小鼠基因型的鉴定 | 第40-41页 |
| 3.1.1 小鼠基因组粗提 | 第40页 |
| 3.1.2 PCR鉴定小鼠的基因型 | 第40-41页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9系统介导的Rcan2-1敲除小鼠(Rcan2-1~(-/-))和Rcan2-3敲除小鼠(Rcan2-3~(-/-))的制作 | 第41-54页 |
| 3.2.1 Rcan2-1敲除(Rcan2-1~(-/-))和Rcan2-3敲除(Rcan2-3~(-/-))的靶点设计 | 第41-42页 |
| 3.2.2 构建携带靶点序列的pX330打靶载体 | 第42-47页 |
| 3.2.2.1 携带BbsI粘性末端的靶点序列的设计与合成 | 第42-43页 |
| 3.2.2.2 退火合成携带BbsI粘性末端的双链靶点序列 | 第43页 |
| 3.2.2.3 pX330质粒的BbsI酶切 | 第43页 |
| 3.2.2.4 pX330质粒的BbsI酶切产物的胶回收 | 第43-44页 |
| 3.2.2.5 pX330载体骨架与靶点序列的连接反应 | 第44-45页 |
| 3.2.2.6 连接产物的转化 | 第45页 |
| 3.2.2.7 阳性克隆的初筛和测序 | 第45-46页 |
| 3.2.2.8 阳性克隆的扩大培养、甘油保菌和质粒提取 | 第46-47页 |
| 3.2.3 构建靶点验证载体 | 第47-49页 |
| 3.2.3.1 靶点验证片段的扩增和胶回收 | 第47页 |
| 3.2.3.2 靶点验证序列连入pGEM-Teasy载体 | 第47-48页 |
| 3.2.3.3 靶点验证序列连入pCAG-EGxxFP质粒 | 第48-49页 |
| 3.2.4 在细胞水平上验证靶点突变效率 | 第49页 |
| 3.2.4.1 HEK293T细胞的培养 | 第49页 |
| 3.2.4.2 靶点验证质粒与pX330打靶载体质粒共转HEK293T细胞 | 第49页 |
| 3.2.5 体外转录Cas9 RNA和gRNA | 第49-53页 |
| 3.2.5.1 体外转录Cas9 RNA | 第50-52页 |
| 3.2.5.1.1 Cas9 RNA体外转录模板的制备与纯化 | 第50-51页 |
| 3.2.5.1.2 体外转录Cas9 RNA | 第51-52页 |
| 3.2.5.2 体外转录Rcan2-1、Rcan2-3特异的gRNA | 第52-53页 |
| 3.2.5.2.1 gRNA体外转录模板的制备与纯化 | 第52页 |
| 3.2.5.2.2 体外转录gRNA | 第52-53页 |
| 3.2.6 打靶载体的显微注射 | 第53页 |
| 3.2.6.1 受精卵和显微注射用核酸的准备 | 第53页 |
| 3.2.6.2 显微注射 | 第53页 |
| 3.2.7 阳性小鼠的筛选和纯合突变小鼠的获得 | 第53-54页 |
| 3.2.7.1 阳性小鼠的筛选 | 第53页 |
| 3.2.7.2 纯合小鼠的获得 | 第53-54页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9系统介导的Rcan2-1~(LacZ)、Rcan2-3~(LacZ)小鼠的制作 | 第54页 |
| 3.4 Tol2转座子系统介导的Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)小鼠的制作 | 第54-62页 |
| 3.4.1 小鼠脑RNA的提取 | 第54-55页 |
| 3.4.2 小鼠脑cDNA的制备 | 第55页 |
| 3.4.3 Rcan2-1/FLAG序列扩增与纯化、pGEM-Teasy+Rcan2-1/FLAG载体的构建 | 第55-56页 |
| 3.4.4 转基因载体pRP (Exp)-EF1α>Rcan2-1/FLAG的构建 | 第56-57页 |
| 3.4.5 Rcan2-1/FLAG的启动子替换(EF1a→CMV) | 第57-58页 |
| 3.4.6 Rcan2-1/FLAG转基因载体的改造 | 第58-59页 |
| 3.4.7 Rcan2-3/FLAG的启动子替换(EF1α→CMV) | 第59-60页 |
| 3.4.8 Rcan2-1/FLAG、Rcan2-3/FLAG体外表达检测 | 第60页 |
| 3.4.9 Rcan2-1/FLAG、Rcan2-3/FLAG转入To12转座子系统 | 第60-61页 |
| 3.4.10 体外转录转座酶(TPase) RNA | 第61页 |
| 3.4.11 质粒pTol2-CMV>Rcan2-1/FLAG、pTol2-CMV >Rcan2-3/FLAG的纯化 | 第61页 |
| 3.4.12 显微注射与转基因小鼠的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.5 体重监测实验 | 第62页 |
| 3.6 小鼠体重、组织重量、体长等指标的测定 | 第62页 |
| 3.7 小鼠组织蛋白的提取 | 第62-63页 |
| 3.8 Western blot检测目的蛋白的表达情况 | 第63页 |
| 3.9 小鼠组织RNA提取、反转录与实时荧光定量PCR | 第63-64页 |
| 3.9.1 小鼠组织RNA的提取、反转录获得cDNA | 第63-64页 |
| 3.9.2 实时荧光定量PCR | 第64页 |
| 3.10 小鼠组织RT-PCR实验 | 第64-65页 |
| 3.10.1 小鼠组织RNA的提取、反转录获得cDNA | 第64页 |
| 3.10.2 RT-PCR检测目的基因的表达情况 | 第64-65页 |
| 3.11 小鼠组织的石蜡切片与苏木精-伊红染色(H&E染色) | 第65-66页 |
| 3.11.1 小鼠组织的石蜡切片 | 第65页 |
| 3.11.2 石蜡切片的苏木精-伊红染色(H&E染色) | 第65-66页 |
| 3.12 小鼠胚胎、脑、脊髓的X-Gal染色 | 第66-67页 |
| 3.12.1 小鼠胚胎的X-Gal染色 | 第66页 |
| 3.12.2 小鼠脑、脊髓的X-Gal染色 | 第66-67页 |
| 3.13 统计学分析 | 第67-68页 |
| 4 实验结果 | 第68-95页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9介导的Rcan2-1、Rcan2-3突变小鼠模型的建立 | 第68-73页 |
| 4.1.1 Rcan2-1 Rcan2-3靶点设计 | 第68页 |
| 4.1.2 打靶载体的构建及靶点突变效率验证 | 第68-69页 |
| 4.1.3 打靶载体的显微注射 | 第69-71页 |
| 4.1.4 Rcan2-1、Rcan2-3突变类型分析 | 第71-73页 |
| 4.1.4.1 Rcan2-1突变小鼠类型 | 第71-72页 |
| 4.1.4.2 Rcan2-3突变小鼠类型 | 第72-73页 |
| 4.2 Rcan2-1敲除小鼠、Rcan2-3敲除小鼠的筛选与鉴定 | 第73-76页 |
| 4.2.1 Rcan2-1敲除小鼠的筛选建系 | 第73页 |
| 4.2.2 Rcan2-3敲除小鼠的筛选建系 | 第73-74页 |
| 4.2.3 Rcan2-1敲除小鼠、Rcan2-3敲除小鼠的基因型鉴定 | 第74页 |
| 4.2.4 Rcan2-1敲除小鼠、Rcan2-3敲除小鼠RNA水平的表达验证 | 第74-75页 |
| 4.2.5 Rcan2两种剪切变体在RNA水平上的表达量关系 | 第75-76页 |
| 4.3 高脂肪食物喂养下，Rcan2-1敲除、Rcan2-3敲除对小鼠体重的影响 | 第76-81页 |
| 4.3.1 高脂肪食物喂养下，Rcan2-1敲除对小鼠生长和体重的影响 | 第76-78页 |
| 4.3.2 高脂肪食物喂养下，Rcan2-3敲除对小鼠生长和体重的影响 | 第78-79页 |
| 4.3.3 高脂肪食物喂养下，野生型小鼠、Rcan2-1~(-/-)小鼠、Rcan2-3~(-/-)小鼠的脂肪、肝脏、肾脏的组织形态学分析 | 第79-81页 |
| 4.4 Rcan2-1~(LacZ)、Rcan2-3~(LacZ)小鼠模型的建立及Rcan2-1、Rcan2-3的表达分布 | 第81-90页 |
| 4.4.1 Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠的设计策略 | 第81-82页 |
| 4.4.2 Rcan2-1~(LacZ)小鼠的获得 | 第82-83页 |
| 4.4.3 Rcan2-3~(LacZ)小鼠的获得 | 第83-84页 |
| 4.4.4 Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠的基因型鉴定 | 第84-85页 |
| 4.4.5 Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠RNA水平的表达验证 | 第85-86页 |
| 4.4.6 Rcan2-1~(LacZ)小鼠、Rcan2-3~(LacZ)小鼠中LacZ蛋白的表达情况 | 第86页 |
| 4.4.7 Rcan2两种剪切变体的表达分布 | 第86-90页 |
| 4.4.7.1 Rcan2两种剪切变体在胚胎时期的表达分布 | 第87-88页 |
| 4.4.7.2 Rcan2两种剪切变体在成体小鼠中枢神经系统中的表达分布 | 第88-90页 |
| 4.5 Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠的制作与鉴定 | 第90-95页 |
| 4.5.1 Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠设计与相关载体的构建 | 第90-93页 |
| 4.5.2 Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠的鉴定 | 第93页 |
| 4.5.3 Rcan2-1~(FLAG)、Rcan2-3~(FLAG)转基因小鼠FLAG融合蛋白的表达检测 | 第93-95页 |
| 5 讨论 | 第95-102页 |
| 参考文献 | 第102-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 攻读硕士研究生期间发表的主要学术论文情况 | 第111-112页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第112页 |
