| 中文摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第17-37页 |
| 1.1 素的重要性及其对植物生长发育的影响 | 第17-19页 |
| 1.1.1 氮素的重要性 | 第17页 |
| 1.1.2 氮素对植物生长发育的影响 | 第17-18页 |
| 1.1.3 过量施用氮肥的危害 | 第18-19页 |
| 1.2 植物吸收利用氮素的分子机制 | 第19-26页 |
| 1.2.1 植物吸收NO_3~-的生理机制 | 第19-24页 |
| 1.2.2.1 NRT1家族转运蛋白系统 | 第20-22页 |
| 1.2.2.2 NRT2家族转运蛋白系统 | 第22-23页 |
| 1.2.2.3 SLAC家族转运蛋白 | 第23页 |
| 1.2.2.4 CLC家族转运蛋白 | 第23-24页 |
| 1.2.3 植物对NH_4~+的吸收 | 第24-25页 |
| 1.2.4 NO_3~-在植物体内的同化 | 第25-26页 |
| 1.3 植物中NO_3~-调控基因的研究 | 第26-34页 |
| 1.3.1 植物中在长期效应中起作用的基因 | 第26-28页 |
| 1.3.2 植物中在短期效应中起作用的基因 | 第28-34页 |
| 1.3.2.1 NRT1.1基因对NO_3~-调控的重要作用 | 第28-30页 |
| 1.3.2.2 CIPK8基因是一个NO_3~-正调控基因 | 第30页 |
| 1.3.2.3 NLP基因家族对NO_3~-调控非常重要 | 第30-31页 |
| 1.3.2.4 LBD37/38/39在NO_3~-调控中的作用 | 第31-32页 |
| 1.3.2.5 NRG2基因在NO_3~-调控中的重要作用 | 第32-33页 |
| 1.3.2.6 利用系统生物学找到的NO_3~-调控基因 | 第33-34页 |
| 1.4 拟南芥NO_3~-调控基因突变体的筛选系统 | 第34-35页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第35-37页 |
| 2 材料与方法 | 第37-60页 |
| 2.1 实验材料 | 第37-43页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第37页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第37页 |
| 2.1.3 酶与试剂 | 第37-41页 |
| 2.1.3.1 酶 | 第37页 |
| 2.1.3.2 试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.3.3 试剂盒 | 第38页 |
| 2.1.3.4 溶液、缓冲液及培养基配方 | 第38-41页 |
| 2.1.4 仪器与设备 | 第41-42页 |
| 2.1.5 引物 | 第42-43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-60页 |
| 2.2.1 植物材料准备及拟南芥植株的生长 | 第43-46页 |
| 2.2.1.1 培养基的配制 | 第43-44页 |
| 2.2.1.2 种子的消毒处理 | 第44页 |
| 2.2.1.3 拟南芥种子的竖直培养 | 第44页 |
| 2.2.1.4 六孔板培养法 | 第44-45页 |
| 2.2.1.5 Magenta Box培养法 | 第45页 |
| 2.2.1.6 植株的正常生长 | 第45页 |
| 2.2.1.7 拟南芥的杂交 | 第45-46页 |
| 2.2.2 拟南芥基因组的提取 | 第46页 |
| 2.2.3 拟南芥NO_3~-调控基因突变体筛选系统的EMS诱变 | 第46-47页 |
| 2.2.3.1 EMS诱变 | 第46-47页 |
| 2.2.3.2 荧光筛选 | 第47页 |
| 2.2.4 图位克隆 | 第47-48页 |
| 2.2.4.1 材料的挑选 | 第47页 |
| 2.2.4.2 初步定位 | 第47-48页 |
| 2.2.4.3 精细定位 | 第48页 |
| 2.2.4.4 PCR扩增 | 第48页 |
| 2.2.4.5 通过测序确定基因 | 第48页 |
| 2.2.5 构建转基因株系表达载体 | 第48-54页 |
| 2.2.5.1 植物总RNA的提取(试剂盒法) | 第49页 |
| 2.2.5.2 反转录 | 第49-50页 |
| 2.2.5.3 Phusion PCR扩增 | 第50页 |
| 2.2.5.4 PCR产物回收(试剂盒法) | 第50-51页 |
| 2.2.5.5 TOPO连接反应 | 第51页 |
| 2.2.5.6 大肠杆菌感受态的制备 | 第51-52页 |
| 2.2.5.7 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第52页 |
| 2.2.5.8 质粒提取 | 第52-53页 |
| 2.2.5.9 DNA序列的测定 | 第53页 |
| 2.2.5.10 LR反应 | 第53页 |
| 2.2.5.11 质粒DNA的酶切鉴定 | 第53-54页 |
| 2.2.6 农杆菌介导的拟南芥的遗传转化 | 第54-55页 |
| 2.2.6.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备 | 第54页 |
| 2.2.6.2 表达载体转化农杆菌 | 第54-55页 |
| 2.2.6.3 拟南芥的转化 | 第55页 |
| 2.2.7 qPCR实验技术 | 第55-56页 |
| 2.2.8 GUS染色分析 | 第56页 |
| 2.2.9 硝态氮含量测定 | 第56-57页 |
| 2.2.9.1 标准曲线的制作 | 第57页 |
| 2.2.9.2 样品中硝态氮含量的测定 | 第57页 |
| 2.2.10 NR活性的测定(试剂盒法) | 第57-58页 |
| 2.2.10.1 测定原理 | 第57-58页 |
| 2.2.10.2 样品的测定与NR活性计算 | 第58页 |
| 2.2.11 氨基酸含量的测定(试剂盒法) | 第58-59页 |
| 2.2.11.1 测定原理 | 第58页 |
| 2.2.11.2 样品中氨基酸的提取与测定 | 第58-59页 |
| 2.2.12 统计学方法 | 第59-60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-92页 |
| 3.1 拟南芥NO_3~-响应缺陷型突变体Mut65的分离与CPSF30基因的图位克隆 | 第60-63页 |
| 3.1.1 拟南芥Mut65突变体的荧光表型 | 第60页 |
| 3.1.2 CPSF30基因的图位克隆及其基因结构 | 第60-62页 |
| 3.1.3 cpsf30-2突变体的表型是由CPSF30-L基因突变造成 | 第62-63页 |
| 3.2 CPSF30基因对NO_3~-调控功能的验证 | 第63-66页 |
| 3.2.1 cpsf30-2突变体中受NO_3~-诱导基因的表达 | 第63-64页 |
| 3.2.2 氮饥饿条件下cpsf30-2突变体中受NO_3~-诱导基因的表达 | 第64-65页 |
| 3.2.3 CPSF30基因对氮素的响应 | 第65-66页 |
| 3.3 CPSF30基因的组织表达与亚细胞定位 | 第66-70页 |
| 3.3.1 CPSF30基因的组织表达 | 第67-68页 |
| 3.3.1.1 qPCR检测CPSF30基因在各部位的表达 | 第67页 |
| 3.3.1.2 GUS染色分析 | 第67-68页 |
| 3.3.2 CPSF30蛋白的亚细胞定位 | 第68-70页 |
| 3.3.2.1 CPSF30蛋白在拟南芥稳定转化植株的表达 | 第68-69页 |
| 3.3.2.2 CPSF30蛋白在烟草表皮细胞的瞬时转化表达 | 第69-70页 |
| 3.4 cpsf30-2突变体的NO_3~-含量分析 | 第70-76页 |
| 3.4.1 cpsf30-2突变体的NO_3~-含量 | 第70页 |
| 3.4.2 cpsf30-2突变体对NO_3~-的吸收 | 第70-71页 |
| 3.4.3 cpsf30-2突变体中的转运基因的表达水平 | 第71-74页 |
| 3.4.4 cpsf30-2突变体中同化基因的表达水平 | 第74-75页 |
| 3.4.5 cpsf30-2突变体的NR活性及氨基酸含量分析 | 第75-76页 |
| 3.5 CPSF30与其他NO_3~-调控基因之间的调控关系 | 第76-87页 |
| 3.5.1 CPSF30与NRT1.1基因之间的调控关系 | 第76-82页 |
| 3.5.1.1 CPSF30与NRT1.1基因之间的调控关系 | 第76-77页 |
| 3.5.1.2 cpsf30-2 chl1-13双突变体中荧光表型 | 第77-79页 |
| 3.5.1.3 cpsf30-2 chl1-13双突变体中NO_3~-响应基因的表达 | 第79页 |
| 3.5.1.4 NRT1.1/cpsf30-2互补株系中荧光表型 | 第79-80页 |
| 3.5.1.5 NRT1.1/cpsf30-2互补株系中的NO_3~-含量 | 第80-81页 |
| 3.5.1.6 NRT1.1/cpsf30-2互补株系中的NO_3~-诱导基因表达 | 第81-82页 |
| 3.5.2 CPSF30与NLP7基因之间的调控关系 | 第82-85页 |
| 3.5.2.1 CPSF30与NLP7基因之间的调控关系 | 第82-83页 |
| 3.5.2.2 cpsf30-2 nlp7双突变体中荧光表型 | 第83-85页 |
| 3.5.2.3 cpsf30-2 nlp7-4双突变体中NO_3~-响应基因的表达 | 第85页 |
| 3.5.3 CPSF30与CIPK8、CIPK23基因之间的调控关系 | 第85-86页 |
| 3.5.4 CPSF30与其他几个NO_3~-调控基因之间的关系 | 第86-87页 |
| 3.6 cpsf30-2突变体与野生型的转录组分析 | 第87-92页 |
| 3.6.1 测序数据质量评估 | 第87-88页 |
| 3.6.2 差异表达基因统计 | 第88-89页 |
| 3.6.3 差异表达基因的GO分析 | 第89-92页 |
| 4 讨论 | 第92-95页 |
| 5 结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第110页 |
