| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-21页 |
| ·引言 | 第9页 |
| ·L-赖氨酸的生产方法 | 第9-10页 |
| ·抽提法 | 第9-10页 |
| ·化学合成法 | 第10页 |
| ·发酵法 | 第10页 |
| ·L-赖氨酸生产途径介绍 | 第10-13页 |
| ·天冬氨酸途径的介绍 | 第11-12页 |
| ·天冬氨酸途径各个酶功能的介绍 | 第12-13页 |
| ·别构酶的抑制机理 | 第13-14页 |
| ·别构蛋白的改造 | 第14-15页 |
| ·二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS) | 第15-19页 |
| ·DHDPS 的催化机制 | 第16-17页 |
| ·DHDPS 的反馈抑制机制 | 第17页 |
| ·不同物种 DHDPS 受赖氨酸抑制程度不同 | 第17-18页 |
| ·大肠杆菌 DHDPS 的研究进展 | 第18-19页 |
| ·以大肠杆菌基础构建 L-赖氨酸生产的新型菌株 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-36页 |
| ·材料部分 | 第21-25页 |
| ·菌株和质粒 | 第21-23页 |
| ·酶和试剂 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·溶液 | 第23-24页 |
| ·引物 | 第24-25页 |
| ·试剂盒 | 第25页 |
| ·实验方法 | 第25-36页 |
| ·E. coli 基因组的提取 (采用 Biomiga 基因组提取试剂盒) | 第25-26页 |
| ·PCR 反应 | 第26-27页 |
| ·基因片段回收 | 第27-28页 |
| ·质粒提取 | 第28页 |
| ·酶切反应 | 第28-29页 |
| ·质粒和 PCR 产物的连接反应 | 第29页 |
| ·化学转化感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| ·化学转化 | 第30页 |
| ·电转化感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·电转化反应 | 第30-31页 |
| ·生长曲线的测定 | 第31页 |
| ·蛋白质的诱导表达和处理 | 第31页 |
| ·蛋白质纯化(4℃冷库中操作)(根据 GE 蛋白纯化说明书操作) | 第31-32页 |
| ·蛋白质定量(使用 thremo 蛋白定量试剂盒，根据说明书操作) | 第32页 |
| ·SDS-PAGE 蛋白质电泳 | 第32页 |
| ·酶活测定 | 第32-33页 |
| ·DHDPS 和天冬氨酸激酶Ⅲ(AKⅢ)蛋白质表达质粒构建 | 第33-34页 |
| ·摇瓶发酵培养基成分 | 第34页 |
| ·批次发酵培养基成分 | 第34-36页 |
| 第三章 通过结构改造解除赖氨酸对大肠杆菌 DHDPS 的反馈抑制 | 第36-58页 |
| ·DHDPS 多序列比对 | 第36-38页 |
| ·大肠杆菌 DHDPS 和谷氨酸棒杆状菌 DHDPS 的结构分析 | 第38-39页 |
| ·大肠杆菌 dapA 及 dapB 基因的获得 | 第39-44页 |
| ·基因组提取 | 第39-40页 |
| ·pSGL1 质粒的构建 | 第40-42页 |
| ·pSGL2 质粒的构建 | 第42-44页 |
| ·蛋白质表达与纯化 | 第44-47页 |
| ·生长曲线的测定 | 第45页 |
| ·蛋白质表达 | 第45-47页 |
| ·E. coli dapA 位点突变 | 第47-49页 |
| ·酶活测定结果 | 第49-55页 |
| ·大肠杆菌 DHDPS 位点 56 和 84 的突变结果 | 第49-51页 |
| ·大肠杆菌 DHDPS 49 和 51 位点突变结果 | 第51-55页 |
| ·大肠杆菌 DHDPS 56 及 84 位点突变酶的动力学比较 | 第55-57页 |
| ·本章小结 | 第57-58页 |
| 第四章 谷氨酸棒杆状菌 DHDPS 别构位点的改造 | 第58-63页 |
| ·谷氨酸棒杆菌 dapA 基因的克隆及表达质粒的构建 | 第58-59页 |
| ·点突变 | 第59-60页 |
| ·谷氨酸棒状杆菌 DHDPS 及其突变体的酶活 | 第60-62页 |
| ·本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 DHDPS 对大肠杆菌生产赖氨酸影响的研究 | 第63-76页 |
| ·质粒构建 | 第63-68页 |
| ·dapA 表达质粒的构建 | 第63-65页 |
| ·共表达 dapA 和 lysC 基因的质粒的构建 | 第65-68页 |
| ·摇瓶发酵实验 | 第68-71页 |
| ·发酵罐发酵 | 第71-76页 |
| 第六章 结论与展望 | 第76-78页 |
| ·结论 | 第76页 |
| ·展望 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
