| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 目录 | 第11-16页 |
| 图片目录 | 第16-17页 |
| 表格目录 | 第17-18页 |
| 符号说明 | 第18-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-42页 |
| 1. 鸡传染性支气管炎概述 | 第21-28页 |
| ·发现简史 | 第21-22页 |
| ·病原学 | 第22-24页 |
| ·分类和形态 | 第22-23页 |
| ·化学结构 | 第23-24页 |
| ·抗原性 | 第24页 |
| ·流行病学 | 第24-26页 |
| ·我国IBV 发生的流行病学新特点 | 第24-25页 |
| ·肉鸡对鸡传粢性支气管炎越来越敏感 | 第24-25页 |
| ·免疫鸡群不断暴发鸡传染性支气管炎 | 第25页 |
| ·IBV 频发的主要原因 | 第25页 |
| ·发病机制 | 第25-26页 |
| ·诊断 | 第26-27页 |
| ·血清学诊断 | 第26页 |
| ·分子生物学诊断 | 第26-27页 |
| ·防治 | 第27-28页 |
| 2. 基因工程单链抗体概述 | 第28-40页 |
| ·单链抗体的结构 | 第29-30页 |
| ·单链抗体基因的扩增 | 第30-31页 |
| ·单链抗体的表达 | 第31-34页 |
| ·表达载体 | 第31-32页 |
| ·质粒载体 | 第31-32页 |
| ·噬菌体载体 | 第32页 |
| ·腺病毒载体 | 第32页 |
| ·表达系统 | 第32-34页 |
| ·细菌 | 第32-33页 |
| ·酵母和丝状真菌 | 第33页 |
| ·植物 | 第33-34页 |
| ·杆状病毒 | 第34页 |
| ·基因工程单链抗体在动物疾病研究中的应用 | 第34-37页 |
| ·在病毒性疾病研究中的应用 | 第34-36页 |
| ·可检测特异病毒并区分不同毒株 | 第34页 |
| ·可用于DIVA 检测 | 第34-35页 |
| ·可抑制病毒复制 | 第35-36页 |
| ·检测特定病原菌感染 | 第36-37页 |
| ·用于寄生虫病的防治 | 第37页 |
| ·scFv 的前景展望 | 第37-40页 |
| ·提供可控制的“基因敲除” | 第38页 |
| ·应用 | 第38-40页 |
| 3. 研究目的和意义 | 第40-42页 |
| 第二章 抗IBV 单链抗体原核表达质粒的构建 | 第42-72页 |
| 1. 材料 | 第42-46页 |
| ·实验动物、毒株与菌种 | 第42-43页 |
| ·主要试剂 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43-44页 |
| ·主要溶液的配制 | 第44-46页 |
| 2. 实验方法 | 第46-59页 |
| ·鸡的免疫及阴性、阳性血清制备 | 第47页 |
| ·阴性血清的制备 | 第47页 |
| ·鸡的免疫及阳性血清的制备 | 第47页 |
| ·脾脏总RNA 提取 | 第47-48页 |
| ·液氮研磨病料 | 第47页 |
| ·Trizol 法提取总RNA | 第47-48页 |
| ·引物设计 | 第48页 |
| ·目的基因的扩增 | 第48-52页 |
| ·RT-PCR 扩增cDNA 第一链 | 第49页 |
| ·VH、VL 基因的扩增 | 第49-50页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第50页 |
| ·PCR 产物的回收纯化 | 第50-51页 |
| ·VH-Linker、VL-Linker 的扩增 | 第51-52页 |
| ·scFv 原核表达质粒的构建与鉴定 | 第52-56页 |
| ·scFv 的扩增 | 第52-53页 |
| ·质粒提取 | 第53-54页 |
| ·PCR 产物scFv 与质粒pOPE101-XP 连接反应 | 第54-55页 |
| ·双酶切鉴定 | 第55页 |
| ·转化感受态细胞JM109(DE3) | 第55页 |
| ·菌落PCR 鉴定 | 第55-56页 |
| ·可溶性scFv 的诱导表达 | 第56页 |
| ·周质腔中scFv 提取 | 第56页 |
| ·测序 | 第56-57页 |
| ·SDS-PAGE 鉴定重组蛋白的表达 | 第57页 |
| ·可溶性scFv 的纯化 | 第57-58页 |
| ·紫外分光光度法测周质腔中scFv 浓度 | 第58-59页 |
| 3. 结果 | 第59-69页 |
| ·目的基因扩增结果 | 第59-60页 |
| ·VH、VL 基因的扩增 | 第59-60页 |
| ·scFv 基因的扩增 | 第60页 |
| ·质粒提取 | 第60-61页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第61-62页 |
| ·重组质粒转化感受态细胞JM109(DE3) | 第62页 |
| ·菌落PCR 鉴定 | 第62-63页 |
| ·测序结果及Blast 序列分析 | 第63-67页 |
| ·重组质粒的诱导表达结果 | 第67-68页 |
| ·紫外分光光度法测样品中scFv 浓度 | 第68-69页 |
| 4. 讨论 | 第69-72页 |
| 第三章 间接ELISA 筛选方法的建立及试验条件优化 | 第72-96页 |
| 第一节 抗原的制备及纯化鉴定 | 第74-85页 |
| 1. 材料 | 第74-76页 |
| ·实验动物、毒株与抗体 | 第74页 |
| ·主要试剂、溶液配制 | 第74-75页 |
| ·主要仪器、器材 | 第75-76页 |
| 2. 实验方法 | 第76-81页 |
| ·IBV M41 抗原的制备 | 第76-77页 |
| ·接种前的准备 | 第76页 |
| ·IBV M41 接种SPF 鸡胚 | 第76-77页 |
| ·收获鸡胚尿囊液 | 第77页 |
| ·病毒液的浓缩 | 第77-78页 |
| ·尿囊液前处理 | 第77页 |
| ·透析袋前处理 | 第77-78页 |
| ·病毒液浓缩 | 第78页 |
| ·病毒液的纯化 | 第78-79页 |
| ·超速离心法 | 第78页 |
| ·蔗糖密度梯度离心法 | 第78-79页 |
| ·去蔗糖超速离心 | 第79页 |
| ·Western blotting 检测IBV 与scFv 反应性 | 第79-81页 |
| ·紫外分光光度法测病毒浓度 | 第81页 |
| 3. 结果 | 第81-83页 |
| ·蔗糖密度梯度离心纯化病毒 | 第81页 |
| ·Western blotting 鉴定结果 | 第81页 |
| ·紫外分光光度法测病毒浓度 | 第81-83页 |
| 4. 讨论 | 第83-85页 |
| 第二节 间接ELISA 筛选方法的建立 | 第85-96页 |
| 1. 材料 | 第85-86页 |
| ·病毒、抗体 | 第85页 |
| ·主要试剂、溶液配制 | 第85-86页 |
| ·主要仪器、器材 | 第86页 |
| 2. 实验方法 | 第86-89页 |
| ·间接ELISA 操作程序 | 第86-87页 |
| ·间接ELISA 方法反应条件初探 | 第87页 |
| ·间接ELISA 方法最佳反应条件的确定 | 第87-88页 |
| ·阳性血清确定抗原最佳包被浓度 | 第87-88页 |
| ·单链抗体样品最佳稀释倍数的确定 | 第88页 |
| ·封闭条件的确定 | 第88页 |
| ·敏感性实验 | 第88页 |
| ·交叉性实验 | 第88-89页 |
| ·重复性实验 | 第89页 |
| 3. 结果 | 第89-94页 |
| ·间接ELISA 初测样品中scFv 的效价 | 第89页 |
| ·阳性血清确定抗原最佳包被浓度 | 第89-90页 |
| ·可溶性scFv 最佳反应浓度 | 第90-91页 |
| ·封闭条件的确定 | 第91-92页 |
| ·敏感性实验 | 第92-93页 |
| ·交叉性实验 | 第93页 |
| ·重复性实验 | 第93-94页 |
| 4. 讨论 | 第94-96页 |
| 第四章 全文总结 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-110页 |
| 攻读硕士期间发表的论文 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
