| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第8-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1 HCoSV 的研究进展 | 第12-13页 |
| 2 病原学 | 第13-16页 |
| ·形态学特征 | 第13页 |
| ·基因组结构 | 第13-15页 |
| ·遗传分类 | 第15页 |
| ·体外培养 | 第15-16页 |
| ·致病性 | 第16页 |
| 3 流行病学 | 第16-17页 |
| ·分子流行病学 | 第16-17页 |
| ·环境中的HCoSV | 第17页 |
| 4 HCoSV 的检测方法 | 第17-22页 |
| ·微生物学检测 | 第17-18页 |
| ·电镜(EM)直接观察法 | 第17-18页 |
| ·免疫电镜法 | 第18页 |
| ·免疫学检测技术 | 第18-19页 |
| ·免疫吸附凝集试验 | 第18页 |
| ·酶联免疫试验 | 第18-19页 |
| ·分子生物学检测 | 第19-22页 |
| ·RT-PCR 方法 | 第20-21页 |
| ·核酸杂交法 | 第21页 |
| ·荧光定量RT-PCR 法 | 第21-22页 |
| ·宏基因组学( metagenomics) | 第22页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 HCoSV 套式PCR 检测方法的建立及应用 | 第23-31页 |
| 1 材料 | 第23-24页 |
| ·粪便样本 | 第23页 |
| ·病毒样品 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-25页 |
| ·引物的设计与合成 | 第24页 |
| ·病毒总RNA 的提取 | 第24-25页 |
| ·cDNA 的合成 | 第25页 |
| 3 套式PCR 方法的建立 | 第25-26页 |
| ·PCR 条件的优化 | 第25页 |
| ·PCR 扩增 | 第25-26页 |
| ·PCR 产物克隆与DNA 序列分析 | 第26页 |
| ·PCR 特异性试验 | 第26页 |
| ·PCR 灵敏性试验 | 第26页 |
| ·套式PCR检测方法的应用 | 第26页 |
| 4 结果 | 第26-29页 |
| ·最佳的PCR 反应条件 | 第26-27页 |
| ·PCR 法的特异性 | 第27-28页 |
| ·PCR 法的灵敏性 | 第28页 |
| ·临床样品的检测 | 第28-29页 |
| 5 讨论 | 第29-31页 |
| 第三章 HCoSV 基因组的扩增及序列分析 | 第31-49页 |
| 1 技术原理 | 第31-32页 |
| 2 引物设计 | 第32-34页 |
| 3 反应条件 | 第34-37页 |
| ·染色体步移技术 | 第34-35页 |
| ·1~(st) PCR 反应 | 第34页 |
| ·2~(nd) PCR 反应 | 第34-35页 |
| ·3~(nd) PCR 反应 | 第35页 |
| ·普通PCR 反应条件 | 第35-36页 |
| ·长片段扩增反应条件 | 第36-37页 |
| 4 结果 | 第37-47页 |
| ·HCoSV 本实验毒株基因结构图 | 第37-38页 |
| ·HCoSV 本实验毒株基因组序列信息 | 第38-41页 |
| ·系统分析及进化树 | 第41-47页 |
| 5 讨论 | 第47-49页 |
| 第四章 HCoSV VP3 蛋白的原核表达及纯化 | 第49-61页 |
| 1 材料 | 第49-50页 |
| ·粪便样品、菌株和质粒 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·主要仪器 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-57页 |
| ·引物的设计与合成 | 第50页 |
| ·RT-PCR 反应 | 第50-51页 |
| ·cDNA 的合成 | 第50页 |
| ·PCR 扩增 | 第50-51页 |
| ·目的片段的纯化回收 | 第51-52页 |
| ·目的基因的克隆 | 第52-53页 |
| ·克隆质粒的构建 | 第52页 |
| ·克隆质粒的筛选及制备 | 第52-53页 |
| ·克隆质粒的转化及筛选 | 第52页 |
| ·克隆质粒的提取及鉴定 | 第52-53页 |
| ·原核表达载体PET-30a-VP3 的构建 | 第53-55页 |
| ·双酶切反应 | 第53-54页 |
| ·PET-30a 空载体的线性化双酶切 | 第54-55页 |
| ·目的基因与线性化表达载体pET-30a 的连接 | 第55页 |
| ·原核表达载体的转化与鉴定 | 第55页 |
| ·重组表达载体的诱导表达 | 第55页 |
| ·最优表达时间的确定 | 第55-56页 |
| ·表达产物的纯化 | 第56页 |
| ·包涵体的分离和变性 | 第56页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第56页 |
| ·表达产物的复性 | 第56-57页 |
| 3 结果 | 第57-59页 |
| ·VP3 基因的PCR 结果 | 第57页 |
| ·目的基因的克隆鉴定 | 第57页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第57-58页 |
| ·蛋白原核表达及最优表达时间的确定 | 第58页 |
| ·蛋白的可溶性分析 | 第58-59页 |
| ·蛋白的纯化与复性 | 第59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 第五章 结论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 附录Ⅰ 试剂配置 | 第70-73页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |