| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略语表 | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第11-17页 |
| 1．1 调节脂肪细胞分化的分子机制 | 第11-13页 |
| 1．1．1 转录因子 | 第11页 |
| 1．1．2 脂肪形成的诱导因素 | 第11-12页 |
| 1．1．3 脂肪形成的抑制因素 | 第12-13页 |
| 1．2 脂肪分化相关蛋白(ADFP)背景介绍 | 第13-14页 |
| 1．2．1 脂质与脂滴 | 第13页 |
| 1．2．2 脂滴表面结合蛋白 | 第13页 |
| 1．2．3 脂肪分化相关蛋白 | 第13-14页 |
| 1．3 ADFP的功能研究 | 第14-15页 |
| 1．3．1 参与巨噬细胞的脂质代谢 | 第14页 |
| 1．3．2 刺激纤维母细胞中脂质的聚集和脂滴的形成 | 第14页 |
| 1．3．3 参与肺泡Ⅱ型细胞(EPⅡ)和纤维母细胞间的脂质转移 | 第14-15页 |
| 1．3．4 促进长链脂肪酸的摄取 | 第15页 |
| 1．4 ADFP的调控 | 第15-16页 |
| 1．4．1 环氧化酶抑制物 | 第15页 |
| 1．4．2 长链脂肪酸 | 第15页 |
| 1．4．3 药物的诱导 | 第15-16页 |
| 1．5 与疾病的关系 | 第16页 |
| 1．5．1 与2-型糖尿病(2-DM)的关系 | 第16页 |
| 1．5．2 与动脉粥样硬化的关系 | 第16页 |
| 1．6 本研究的目的意义 | 第16-17页 |
| 2 材料和方法 | 第17-26页 |
| 2．1 材料 | 第17-20页 |
| 2．1．1 RNA样品 | 第17页 |
| 2．1．2 DNA样品 | 第17页 |
| 2．1．2．1 cDNA | 第17页 |
| 2．1．2．2 用于基因片段分离的基因组 DNA | 第17页 |
| 2．1．2．3 用于基因染色体定位的 DNA | 第17页 |
| 2．1．3 工具酶 | 第17页 |
| 2．1．4 试剂盒 | 第17页 |
| 2．1．5 质粒和菌株 | 第17-18页 |
| 2．1．6 细胞 | 第18页 |
| 2．1．7 抗体 | 第18页 |
| 2．1．8 主要生化试剂 | 第18页 |
| 2．1．9 实验动物 | 第18页 |
| 2．1．10 主要仪器 | 第18页 |
| 2．1．11 常用溶液配方 | 第18-19页 |
| 2．1．12 分子生物学软件 | 第19-20页 |
| 2．2 实验方法 | 第20-26页 |
| 2．2．1 猪ADFP基因的克隆、表达与抗血清制备 | 第20-23页 |
| 2．2．1．1 用于扩增ADFP ORF的引物设计 | 第20页 |
| 2．2．1．2 猪脂肪组织总 RNA的提取 | 第20页 |
| 2．2．1．3 cDNA ORF的扩增纯化和测序 | 第20-21页 |
| 2．2．1．4 pGEX-ADFP-C载体的构建鉴定与诱导表达 | 第21-22页 |
| 2．2．1．5 Western blot检测融合蛋白ADFP-C-GST的表达 | 第22页 |
| 2．2．1．6 包涵体的提取和目的蛋白纯化及浓度测定 | 第22页 |
| 2．2．1．7 多克隆抗体制备 | 第22页 |
| 2．2．1．8 ELISA法测定效价 | 第22-23页 |
| 2．2．2 部分猪ADFP基因序列的获得 | 第23页 |
| 2．2．2．1 引物设计 | 第23页 |
| 2．2．2．2 以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增获得部分基因序列 | 第23页 |
| 2．2．3 用辐射杂种细胞系技术(RH)对ADFP进行染色体定位 | 第23-24页 |
| 2．2．3．1 引物设计及特异性检测 | 第23页 |
| 2．2．3．2 IMpRH克隆板 PCR信号的获得 | 第23页 |
| 2．2．3．3 染色体定位 | 第23-24页 |
| 2．2．4 半定量 PCR检测ADFP mRNA水平上的组织分布和相对表达量 | 第24页 |
| 2．2．4．1 脂肪、肝、肌肉等9个组织总 RNA的提取及定量 | 第24页 |
| 2．2．4．2 引物设计 | 第24页 |
| 2．2．4．3 以β-actin为内参确定指数期循环数 | 第24页 |
| 2．2．4．4 指数期内对ADFP进行 RT半定量 PCR | 第24页 |
| 2．2．5 盐酸克伦特罗刺激 COS-7细胞对ADFP基因表达的影响 | 第24-26页 |
| 2．2．5．1 盐酸克伦特罗刺激 COS-7细胞 | 第24-25页 |
| 2．2．5．2 细胞总 RNA的提取 | 第25页 |
| 2．2．5．3 以β-actin 为内参 RT半定量 PCR检测ADFP的表达量变化 | 第25-26页 |
| 3 结果与分析 | 第26-44页 |
| 3．1 ADFP基因的克隆、表达与抗血清制备 | 第26-36页 |
| 3．1．1 猪脂肪组织总 RNA的提取 | 第26页 |
| 3．1．2 cDNA ORF的扩增纯化和测序 | 第26-31页 |
| 3．1．3 质粒pGEX-ADFP-C的构建及鉴定 | 第31-34页 |
| 3．1．4 GST-ADFP-C融合蛋白质的诱导表达与鉴定 | 第34-35页 |
| 3．1．5 GST-ADFP-C的纯化和定量 | 第35-36页 |
| 3．1．6 多克隆抗体的制备和效价检测 | 第36页 |
| 3．2 部分猪ADFP基因序列的获得 | 第36-38页 |
| 3．2．1 以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增获得部分基因序列 | 第36-37页 |
| 3．2．2 基因结构分析 | 第37-38页 |
| 3．3 猪ADFP基因的染色体定位 | 第38-40页 |
| 3．3．1 引物检测及以IMpRH克隆板为模板的 PCR信号的获得 | 第38-39页 |
| 3．3．2 猪ADFP基因的染色体定位 | 第39-40页 |
| 3．4 不同组织ADFP mRNA水平上 RT半定量 PCR检测 | 第40-41页 |
| 3．4．1 脂肪、肝、肌肉等9个组织总 RNA的提取及定量 | 第40页 |
| 3．4．2 脂肪、肝、肌肉等9个组织ADFP mRNA水平的半定量 | 第40-41页 |
| 3．5 盐酸克伦特罗刺激 COS-7细胞对ADFP基因表达的影响 | 第41-44页 |
| 4 讨论 | 第44-46页 |
| 4．1 ADFP基因序列和结构在不同物种中的保守性 | 第44页 |
| 4．2 辐射杂种板细胞系技术作为一种基因定位方法的优缺点 | 第44-45页 |
| 4．3 从 ADFP的分布看脂肪沉积的模式 | 第45-46页 |
| 5 小结 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-52页 |
| 研究生在读期间论文发表情况 | 第52-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 附录 | 第54-56页 |
