| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-13页 |
| 前言 | 第13-15页 |
| 文献综述 | 第15-29页 |
| 第一部分 体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的策略与应用 | 第15-20页 |
| 1 体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的技术关键 | 第15-16页 |
| ·体细胞基因打靶的技术优越性 | 第15-16页 |
| ·体细胞核移植的技术平台 | 第16页 |
| 2 体细胞基因打靶与核移植的技术难点 | 第16-17页 |
| ·体细胞基因打靶现存的技术难点 | 第16-17页 |
| ·体细胞核移植现存的技术难点 | 第17页 |
| 3 提高体细胞基因打靶效率的策略 | 第17-19页 |
| ·基因打靶方式的选择 | 第17-18页 |
| ·基因打靶细胞的选择 | 第18-19页 |
| 4 提高转基因体细胞核移植效率的方法 | 第19页 |
| 5 进展与展望 | 第19-20页 |
| 第二部分 影响真核基因同源重组发生与基因打靶效率的分子机制 | 第20-29页 |
| 1 同源重组与 DNA 修复 | 第20页 |
| 2 非同源末端结合(NHEJ)与随机整合 | 第20-21页 |
| 3 DT40 细胞与条件性基因敲除在研究 HR 时的特殊作用 | 第21-22页 |
| 4 同源重组相关基因的表达调控 | 第22-23页 |
| 5 DNA 修复信号通路与打靶同源重组 | 第23-25页 |
| 6 DNA特异性损伤介导基因同源重组 | 第25-26页 |
| ·核酸内切酶 | 第25页 |
| ·三链寡核苷酸 | 第25-26页 |
| 7 打靶策略的选择与打靶载体的设计 | 第26-27页 |
| 8 结语 | 第27-29页 |
| 试验研究 | 第29-84页 |
| 第三部分 山羊β-casein 5?调控区的克隆及其指导ht-PAm在家兔乳腺中表达 | 第29-41页 |
| 1 材料与方法 | 第29-32页 |
| ·材料 | 第29-30页 |
| ·pGBC5 的克隆与序列分析 | 第30页 |
| ·乳腺表达载体 pGBC2htPAm 构建 | 第30页 |
| ·ht-PAm 在乳腺细胞中的暂时表达与活性检测 | 第30-31页 |
| ·睾丸介导基因转移制备转基因兔 | 第31页 |
| ·转基因兔的检测 | 第31-32页 |
| 2 结果与分析 | 第32-38页 |
| ·山羊β-casein 基因 5?调控序列的克隆与分析 | 第32-35页 |
| ·pGBC2htPAm 载体的构建与鉴定 | 第35-37页 |
| ·山羊β-casein 基因 5?调控序列与 ht-PAm cDNA 序列的有效性 | 第37页 |
| ·睾丸介导基因转移制备 ht-PAm 转基因兔 | 第37-38页 |
| 3 讨论 | 第38-40页 |
| ·乳腺组织特异性表达调控序列的选择与结构分析 | 第38-39页 |
| ·精子载体法制备转基因动物的可行性与优势 | 第39-40页 |
| ·精子结合外源 DNA 的分子机制 | 第40页 |
| 4 小结 | 第40-41页 |
| 第四部分 山羊β-casein基因打靶载体pGBC4htPAm的构建及鉴定 | 第41-49页 |
| 1 材料与方法 | 第41-42页 |
| ·材料 | 第41-42页 |
| ·基因打靶载体 pGBC4htPAm 构建 | 第42页 |
| ·Cre/loxP 系统的有效性 | 第42页 |
| ·打靶载体正负筛选标记的有效性 | 第42页 |
| 2 结果与分析 | 第42-46页 |
| ·基因打靶载体 pGBC4htPAm 的构建与鉴定 | 第42-46页 |
| ·Cre/loxP 系统的有效性鉴定 | 第46页 |
| ·打靶载体正负筛选标记的有效性检测 | 第46页 |
| 3 讨论 | 第46-48页 |
| ·基因打靶方式的选择与应用 | 第46-47页 |
| ·基因打靶载体设计的原则与技巧 | 第47-48页 |
| ·正负筛选标记基因neo和tk的合理使用 | 第48页 |
| 4 小结 | 第48-49页 |
| 第五部分 山羊胎儿成纤维细胞的基因打靶与中靶细胞克隆的检测 | 第49-60页 |
| 1 材料与方法 | 第49-52页 |
| ·材料 | 第49-50页 |
| ·山羊胎儿成纤维细胞的分离培养与性别鉴定 | 第50页 |
| ·山羊胎儿体细胞染色体的核型分析 | 第50页 |
| ·细胞抗性试验 | 第50-51页 |
| ·电击法转染外源基因 | 第51页 |
| ·脂质体法转染外源基因 | 第51页 |
| ·抗性细胞克隆的挑取 | 第51-52页 |
| ·抗性细胞克隆的冷冻保存 | 第52页 |
| ·打靶细胞克隆的鉴定与分析 | 第52页 |
| 2 结果与分析 | 第52-57页 |
| ·山羊胎儿成纤维细胞的分离培养 | 第52-53页 |
| ·山羊胎儿的性别鉴定与染色体核型分析 | 第53-54页 |
| ·细胞 G418 抗性与电击参数 | 第54-55页 |
| ·山羊体细胞的外源基因转染 | 第55-56页 |
| ·中靶细胞克隆的检测与鉴定 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-59页 |
| ·体细胞基因打靶的技术难点 | 第57-58页 |
| ·靶受体细胞的选择与应用 | 第58-59页 |
| ·不同转染方式进行体细胞基因打靶的效率比较 | 第59页 |
| 4 小结 | 第59-60页 |
| 第六部分 山羊基因打靶体细胞的核移植与胚胎移植 | 第60-69页 |
| 1 材料与方法 | 第60-62页 |
| ·材料 | 第60页 |
| ·山羊卵母细胞的收集 | 第60-61页 |
| ·山羊卵母细胞的体外培养 | 第61页 |
| ·山羊体细胞的核移植 | 第61页 |
| ·核移植胚的激活与体外培养 | 第61-62页 |
| ·核移植胚的胚胎移植与妊娠检测 | 第62页 |
| 2 结果与分析 | 第62-66页 |
| ·山羊卵母细胞的体外培养与成熟 | 第62-63页 |
| ·山羊转基因体细胞的核移植与克隆胚激活 | 第63-64页 |
| ·转基因体细胞克隆胚的体外培养与发育 | 第64-65页 |
| ·山羊转基因克隆胚的胚胎移植 | 第65-66页 |
| 3 讨论 | 第66-68页 |
| ·转基因体细胞核移植的技术难点 | 第66页 |
| ·技术操作过程对核移植效率的影响 | 第66-67页 |
| ·供受体细胞类型与细胞周期对克隆胚发育的影响 | 第67-68页 |
| ·克隆胚基因组的重编程与基因印迹对胚胎发育的影响 | 第68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第七部分 利用多重筛选机制提高乳腺上皮细胞基因打靶的效率 | 第69-76页 |
| 1 材料与方法 | 第69-70页 |
| ·材料 | 第69-70页 |
| ·pGBC-GFP-neo 的构建与鉴定 | 第70页 |
| ·细胞的外源基因转染与阳性细胞克隆的筛选 | 第70页 |
| ·中靶细胞的核移植 | 第70页 |
| 2 结果与分析 | 第70-74页 |
| ·载体 pGBC-GFP-neo 的构建及有效性鉴定 | 第71-72页 |
| ·GFP-neo在山羊β-casein基因座的定位整合 | 第72-73页 |
| ·中靶细胞的核移植 | 第73-74页 |
| 3 讨论 | 第74-75页 |
| ·通用型基因打靶乳腺细胞系建立的意义 | 第74页 |
| ·提高体细胞基因打靶的策略 | 第74-75页 |
| ·乳腺细胞体外诱导表达乳蛋白的可应用性 | 第75页 |
| 4 小结 | 第75-76页 |
| 第八部分 基因打靶导致靶受体细胞过快衰老的分子事件 | 第76-84页 |
| 1 材料与方法 | 第76-78页 |
| ·材料 | 第76页 |
| ·衰老细胞的染色 | 第76页 |
| ·细胞染色体端粒的长度分析 | 第76-77页 |
| ·p16INK4a基因 5?-调控区的甲基化 | 第77页 |
| ·p16INK4a 基因的表达水平 | 第77-78页 |
| 2 结果与分析 | 第78-82页 |
| ·细胞衰老的表征现象与染色分析 | 第78页 |
| ·细胞染色体端粒长度的 Southern 检测 | 第78-80页 |
| ·p16INK4a 基因的 5?-调控区 DNA 甲基化水平 | 第80-81页 |
| ·p16INK4a 基因表达水平的检测 | 第81-82页 |
| 3 讨论 | 第82-83页 |
| ·细胞染色体端区的长度对细胞增殖与核移植的影响 | 第82页 |
| ·DNA 甲基化对 p16INK4a 表达的影响 | 第82-83页 |
| ·p16INK4a/Rb是细胞衰老一条重要的信号通路 | 第83页 |
| 4 小结 | 第83-84页 |
| 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-95页 |
| 附录 | 第95-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 个人简介 | 第102页 |
