| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩写符号 | 第15-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-30页 |
| 前言 | 第18页 |
| 1 Gn2E与唾液酸 | 第18-24页 |
| 1.1 唾液酸的发现 | 第18-19页 |
| 1.2 唾液酸与神经系统发育 | 第19页 |
| 1.3 唾液酸与流感病毒 | 第19-20页 |
| 1.4 唾液酸与恶性肿瘤 | 第20-21页 |
| 1.5 唾液酸的生物合成途径 | 第21-22页 |
| 1.6 唾液酸类似物的合成 | 第22-24页 |
| 2 Gn2E与β-GlcNAc的检测 | 第24-25页 |
| 2.1 检测β-GlcNAc的意义 | 第24页 |
| 2.2 检测糖链末端β-GlcNAc的方法 | 第24-25页 |
| 2.3 利用Gn2E检测β-GlcNAc | 第25页 |
| 3 Gn2E酶的研究现状 | 第25-26页 |
| 4 Pedobacter heparinus相关研究简介 | 第26-27页 |
| 5 本研究的目的意义及内容 | 第27-30页 |
| 第二章 PhGn2E的克隆、表达、纯化及酶学特性测定 | 第30-64页 |
| 1 材料与方法 | 第31-48页 |
| 1.1 材料 | 第31-33页 |
| 1.1.1 菌种 | 第31页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第31页 |
| 1.1.3 培养基 | 第31-32页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第32-33页 |
| 1.2 方法 | 第33-48页 |
| 1.2.1 细菌基因组DNA的提取 | 第33页 |
| 1.2.2 重组蛋白表达载体的构建 | 第33-39页 |
| 1.2.2.1 PCR引物设计 | 第33页 |
| 1.2.2.2 PCR体系与程序 | 第33-34页 |
| 1.2.2.3 PCR产物回收及纯化 | 第34页 |
| 1.2.2.4 DNA片段与中间载体的连接 | 第34-35页 |
| 1.2.2.5 连接产物的转化 | 第35-36页 |
| 1.2.2.6 重组质粒验证及提取 | 第36-37页 |
| 1.2.2.7 载体酶切与连接 | 第37-38页 |
| 1.2.2.8 重组蛋白表达质粒的转化 | 第38页 |
| 1.2.2.9 重组蛋白表达质粒测序及菌种保存 | 第38-39页 |
| 1.2.3 原核蛋白的重组表达与纯化 | 第39-40页 |
| 1.2.3.1 重组蛋白表达载体的转化 | 第39页 |
| 1.2.3.2 重组蛋白质的体外表达 | 第39-40页 |
| 1.2.3.3 重组蛋白的纯化 | 第40页 |
| 1.2.4 重组蛋白质的SDS-PAGE电泳检测及蛋白浓度测定 | 第40-42页 |
| 1.2.5 重组蛋白质的MALDI-TOF-MS验证 | 第42-43页 |
| 1.2.6 重组表达蛋白酶活验证 | 第43-44页 |
| 1.2.7 重组表达蛋白的酶学特性测定 | 第44-48页 |
| 1.2.7.1 最适反应温度的测定 | 第45页 |
| 1.2.7.2 最适反应pH的测定 | 第45页 |
| 1.2.7.3 金属离子对酶活性的影响 | 第45页 |
| 1.2.7.4 变性剂和去污剂对酶活性的影响 | 第45-46页 |
| 1.2.7.5 酶的热稳定性测定 | 第46页 |
| 1.2.7.6 核苷酸对酶活性的影响 | 第46页 |
| 1.2.7.7 底物特异性检测 | 第46-48页 |
| 1.2.7.8 酶的K_m、K_(cat)、最大反应速率及酶活等酶动力学参数的测定 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-61页 |
| 2.1 PhGn2E的PCR扩增与表达载体的构建 | 第48-50页 |
| 2.2 PhGn2E同源序列比对分析 | 第50-53页 |
| 2.3 PhGn2E的体外表达与纯化 | 第53-54页 |
| 2.4 重组蛋白PhGn2E的MALDI-TOF验证 | 第54-55页 |
| 2.5 重组蛋白PhGn2E的活性验证 | 第55页 |
| 2.6 重组蛋白PhGn2E的酶活参数测定 | 第55-61页 |
| 2.6.1 酶最适反应温度的测定 | 第55-56页 |
| 2.6.2 酶最适反应pH的测定 | 第56页 |
| 2.6.3 金属离子对酶活性的影响 | 第56-57页 |
| 2.6.4 变性剂及去污剂对酶活性的影响 | 第57-58页 |
| 2.6.5 酶的热稳定性测定 | 第58-59页 |
| 2.6.6 核苷酸对酶活性的影响 | 第59页 |
| 2.6.7 底物特异性检测 | 第59-60页 |
| 2.6.8 酶的K_m、最大反应速率、K_(cat)等酶动力学参数的测定 | 第60-61页 |
| 3 讨论 | 第61-63页 |
| 4 本章小结 | 第63-64页 |
| 第三章 PhGn2E酶的催化机理研究 | 第64-80页 |
| 1 材料与方法 | 第64-69页 |
| 1.1 材料 | 第64-65页 |
| 1.1.1 试剂 | 第64-65页 |
| 1.1.2 耗材 | 第65页 |
| 1.1.3 菌种 | 第65页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第65页 |
| 1.2 方法 | 第65-69页 |
| 1.2.1 PhGn2E酶的脱盐处理 | 第65-66页 |
| 1.2.2 GlcNAc C-2上的H-D交换 | 第66页 |
| 1.2.3 GlcNAc异头碳上OH1的H-D交换 | 第66页 |
| 1.2.4 PhGn2E酶与端基取代的GlcNAc反应 | 第66-67页 |
| 1.2.5 PhGn2E的定点突变 | 第67-68页 |
| 1.2.6 点突变载体的转化 | 第68页 |
| 1.2.7 蛋白突变体的表达、纯化及SDS-PAGE | 第68页 |
| 1.2.8 蛋白突变体的酶活检测 | 第68-69页 |
| 2 结果与分析 | 第69-78页 |
| 2.1 GlcNAc C-2上的氢氘交换 | 第69-71页 |
| 2.2 GlcNAc异头碳上OH1的氢氘交换 | 第71-72页 |
| 2.3 PhGn2E对端基取代的GlcNAc的异构化反应 | 第72页 |
| 2.4 PhGn2E酶定点突变 | 第72-76页 |
| 2.5 四种蛋白突变体的酶活检测分析 | 第76-78页 |
| 3 讨论 | 第78-79页 |
| 4 本章小结 | 第79-80页 |
| 第四章 唾液酸糖苷类化合物的“一釜四酶”法合成 | 第80-92页 |
| 1 材料与方法 | 第80-83页 |
| 1.1 材料 | 第80-81页 |
| 1.1.1 试剂 | 第80-81页 |
| 1.1.2 主要仪器设备 | 第81页 |
| 1.2 方法 | 第81-83页 |
| 1.2.1 唾液酸糖苷化合物的“一釜四酶”法合成 | 第81-83页 |
| 1.2.2 唾液酸糖苷化合物的HPLC-MS检测 | 第83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-90页 |
| 3 讨论 | 第90-91页 |
| 4 本章小结 | 第91-92页 |
| 第五章 利用PhGn2E酶检测糖链末端的β-GlcNAc | 第92-102页 |
| 1 材料与方法 | 第92-97页 |
| 1.1 材料 | 第92-93页 |
| 1.1.1 试剂 | 第92-93页 |
| 1.1.2 主要仪器设备 | 第93页 |
| 1.2 方法 | 第93-97页 |
| 1.2.1 端基取代的GlcNAc的合成及纯化 | 第93-94页 |
| 1.2.2 酶解反应的可行性分析 | 第94-95页 |
| 1.2.3 检测β-端基取代的GlcNAc含量 | 第95-96页 |
| 1.2.4 微量法定量检测GlcNAc含量 | 第96页 |
| 1.2.5 检测天然复杂糖链末端的β-GlcNAc含量 | 第96-97页 |
| 2 结果与分析 | 第97-99页 |
| 2.1 端基取代的GlcNAc的合成及纯化 | 第97页 |
| 2.2 酶解β-端基取代物的可行性验证 | 第97-98页 |
| 2.3 β-端基取代物的定量测定 | 第98页 |
| 2.4 微量法定量检测天然复杂糖链末端的β-GlcNAc | 第98-99页 |
| 3 讨论 | 第99-101页 |
| 4 本章小结 | 第101-102页 |
| 全文结论 | 第102-104页 |
| 论文创新点 | 第104-106页 |
| 未来研究展望 | 第106-108页 |
| 参考文献 | 第108-118页 |
| 附录 | 第118-128页 |
| 重要化合物谱图 | 第118-128页 |
| 致谢 | 第128-130页 |
| 攻读博士期间发表论文情况 | 第130页 |
