| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词表(Abbreviations) | 第12-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-27页 |
| 1.1 项目背景 | 第13-14页 |
| 1.2 国内外研究、应用进展 | 第14-25页 |
| 1.2.1 β-甘露聚糖酶的国内外研究、应用进展 | 第14-21页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统的研究、应用进展 | 第21-25页 |
| 1.3 存在的问题 | 第25页 |
| 1.4 立题目的、意义及主要研究内容 | 第25-27页 |
| 1.4.1 立题目的、意义 | 第25-26页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第26-27页 |
| 第二章 耐高温 β-甘露聚糖酶天然生产菌种的分离、筛选及鉴定 | 第27-36页 |
| 2.1 前言 | 第27页 |
| 2.2 材料与方法 | 第27-30页 |
| 2.2.1 实验试剂和仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.2 培养基组成 | 第28页 |
| 2.2.3 菌体富集培养及筛选 | 第28页 |
| 2.2.4 菌株鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.5 菌株在不同温度、pH条件下的生长测试 | 第29页 |
| 2.2.6 菌株摇瓶发酵 | 第29页 |
| 2.2.7 BS-Man的部分酶学性质检测 | 第29-30页 |
| 2.2.8 β-甘露聚糖酶酶活检测 | 第30页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第30-35页 |
| 2.3.1 产 β-甘露聚糖酶的菌株筛选 | 第30-31页 |
| 2.3.2 菌种鉴定 | 第31-33页 |
| 2.3.3 TBS2的生长性能 | 第33页 |
| 2.3.4 菌株摇瓶发酵及酶液纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.5 BS-Man的部分酶学性质 | 第34-35页 |
| 2.4 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 耐高温β-甘露聚糖酶重组毕赤酵母工程菌的构建、表达及其酶学性质研究 | 第36-58页 |
| 3.1 前言 | 第36页 |
| 3.2 材料与方法 | 第36-46页 |
| 3.2.1 载体和菌株 | 第36页 |
| 3.2.2 主要工具酶和试剂 | 第36-37页 |
| 3.2.3 主要仪器设备 | 第37页 |
| 3.2.4 培养基和主要试剂配制 | 第37-38页 |
| 3.2.5 TBS2基因组DNA提取及克隆 | 第38-39页 |
| 3.2.6 序列分析及重组表达载体构建 | 第39-42页 |
| 3.2.7 重组毕赤酵母工程菌构建、筛选 | 第42-44页 |
| 3.2.8 高密度液体发酵 | 第44页 |
| 3.2.9 重组耐高温β-甘露聚糖酶的分离、纯化 | 第44页 |
| 3.2.10 酶学性质检测 | 第44-46页 |
| 3.2.11 检测方法 | 第46页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第46-57页 |
| 3.3.1 TBS2基因组提取及克隆 | 第46页 |
| 3.3.2 基因序列分析及重组表达载体构建 | 第46-49页 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母工程菌的构建及筛选 | 第49页 |
| 3.3.4 高密度液体发酵 | 第49-50页 |
| 3.3.5 ReTMan26蛋白纯化 | 第50-51页 |
| 3.3.6 ReTMan26酶学性质 | 第51-57页 |
| 3.4 本章小结 | 第57-58页 |
| 第四章 Re TMan26的耐高温机理分析 | 第58-71页 |
| 4.1 前言 | 第58页 |
| 4.2 材料与方法 | 第58-62页 |
| 4.2.1 表达载体与菌株 | 第58页 |
| 4.2.2 主要工具酶和试剂、培养基配制 | 第58-59页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第59页 |
| 4.2.4 ReTMan26蛋白质三维结构建模及分析 | 第59页 |
| 4.2.5 ReTMan26脱N-糖基化及纯化 | 第59页 |
| 4.2.6 ReTMan26中二硫键定点突变、菌体构建、发酵培养及酶蛋白纯化 | 第59-61页 |
| 4.2.7 稳定性对比实验 | 第61-62页 |
| 4.2.8 酶动力学常数检测 | 第62页 |
| 4.2.9 酶活检测方法 | 第62页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第62-70页 |
| 4.3.1 ReTMan26蛋白质结构分析 | 第62-65页 |
| 4.3.2 ReTMan26脱N-糖基化处理及纯化 | 第65-66页 |
| 4.3.3 二硫键定点突变、菌体构建、发酵培养及酶蛋白纯化 | 第66-67页 |
| 4.3.4 稳定性对比 | 第67-70页 |
| 4.3.5 酶动力学常数 | 第70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 第五章 ReTMan26基因优化、改造及其在毕赤酵母中的高效表达 | 第71-87页 |
| 5.1 引言 | 第71页 |
| 5.2 材料与方法 | 第71-78页 |
| 5.2.1 载体和菌株 | 第71页 |
| 5.2.2 主要工具酶和试剂 | 第71-72页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第72页 |
| 5.2.4 培养基和主要试剂配制 | 第72页 |
| 5.2.5 基因优化、Kozak序列改造及重组质粒构建 | 第72-74页 |
| 5.2.6 重组毕赤酵母工程菌的构建、筛选 | 第74-75页 |
| 5.2.7 基因拷贝数及m RNA丰度检测 | 第75-77页 |
| 5.2.8 高密度液体发酵 | 第77页 |
| 5.2.9 检测方法 | 第77-78页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第78-86页 |
| 5.3.1 密码子优化、Kozak序列改造及重组表达质粒构建 | 第78-81页 |
| 5.3.2 转化及阳性重组子筛选 | 第81-82页 |
| 5.3.3 摇瓶发酵培养及菌株筛选 | 第82页 |
| 5.3.4 基因拷贝数及m RNA丰度 | 第82-84页 |
| 5.3.5 高密度液体发酵 | 第84-86页 |
| 5.4 本章小结 | 第86-87页 |
| 第六章 粗甘油用于ReTMan26发酵生产的研究 | 第87-97页 |
| 6.1 引言 | 第87页 |
| 6.2 材料与方法 | 第87-90页 |
| 6.2.1 生产菌株、培养基及试剂 | 第87页 |
| 6.2.2 主要仪器设备 | 第87-88页 |
| 6.2.3 不控制pH的摇瓶培养 | 第88页 |
| 6.2.4 控制pH的5L罐分批发酵培养 | 第88页 |
| 6.2.5 粗甘油中杂质对毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产的影响 | 第88页 |
| 6.2.6 分批高密度液体发酵 | 第88-89页 |
| 6.2.7 检测方法 | 第89页 |
| 6.2.8 粗甘油成分检测 | 第89-90页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第90-96页 |
| 6.3.1 所用粗甘油性质 | 第90页 |
| 6.3.2 不控制pH的摇瓶培养 | 第90-91页 |
| 6.3.3 控制pH的5L罐分批发酵培养 | 第91-93页 |
| 6.3.4 粗甘油中各杂质对毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产的影响 | 第93-95页 |
| 6.3.5 分批高密度液体发酵 | 第95-96页 |
| 6.4 本章小结 | 第96-97页 |
| 主要结论与展望 | 第97-99页 |
| 1 主要结论 | 第97-98页 |
| 2 展望 | 第98-99页 |
| 论文主要创新点 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-114页 |
| 附录1 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第114页 |
