| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 英文缩写词表 | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 磷脂酶 C 的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.1 磷脂酶 C 发现 | 第13-14页 |
| 1.2 磷脂酶 C 的分类 | 第14-15页 |
| 2 精子因子假说 | 第15-16页 |
| 3 PEGFP-N1 载体 | 第16-17页 |
| 4 卵母细胞的激活方法 | 第17-18页 |
| 4.1 物理激活 | 第17页 |
| 4.2 化学激活 | 第17-18页 |
| 4.3 联合激活 | 第18页 |
| 5 PLCΖ的特异之处 | 第18-22页 |
| 5.1 EF 结构域具有较高的 CA2+敏感性 | 第19-20页 |
| 5.2 PLCΖ的 C2 区域对 CA2+振荡有重要作用 | 第20页 |
| 5.3 PLCΖ的 XY 连接结构具有靶向定位作用 | 第20-21页 |
| 5.4 精子 PLCΖ的缺陷与雄性不育 | 第21-22页 |
| 6 研究目的及意义 | 第22-23页 |
| 第二章 实验内容 | 第23-44页 |
| 试验一 美利奴绵羊磷脂酶 C ZETA 基因真核表达载体的构建及其表达研究 | 第23-31页 |
| 摘要 | 第23页 |
| 2.1 材料 | 第23页 |
| 2.1.1 组织样品 | 第23页 |
| 2.1.2 试剂、质粒及细胞 | 第23页 |
| 2.2 方法 | 第23-26页 |
| 2.2.1 PLCζ基因的扩增 | 第23-24页 |
| 2.2.2 目的基因的回收 | 第24页 |
| 2.2.3 pEGFP-N1-PLCζ重组质粒构建 | 第24页 |
| 2.2.4 重组表达质粒的酶切鉴定 | 第24页 |
| 2.2.5 转染及重组质粒的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.6 pEGFP-N1-PLCζ在 293T 细胞中的表达及定位 | 第25页 |
| 2.2.7 pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达 | 第25-26页 |
| 2.3 结果 | 第26-29页 |
| 2.3.1 绵羊 PLCζ目的基因的扩增 | 第26页 |
| 2.3.2 重组表达质粒 pEGFP-N1-PLCζ的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.3.3 转染后报告基因的检测 | 第27页 |
| 2.3.4 293T 细胞中融合蛋白 PLCζ-EGFP 的定位观察结果 | 第27-28页 |
| 2.3.5 重组表达质粒 pEGFP-N1-PLCζ转染绵羊胎儿成纤维细胞 | 第28页 |
| 2.3.6 阳性细胞的鉴定 | 第28-29页 |
| 2.4 讨论 | 第29-30页 |
| 2.5 小结 | 第30-31页 |
| 试验二 美利奴绵羊 PLCΖ基因的原核表达载体的构建与表达 | 第31-40页 |
| 摘要 | 第31页 |
| 3.1 材料 | 第31页 |
| 3.1.1 菌株、质粒和试剂 | 第31页 |
| 3.1.2 主要仪器设备 | 第31页 |
| 3.2 方法 | 第31-34页 |
| 3.2.1 PLCζ基因的扩增 | 第31-32页 |
| 3.2.2 目的基因的回收 | 第32页 |
| 3.2.3 pCzn1-PLCζ重组质粒构建 | 第32-33页 |
| 3.2.4 pET-28a-PLCζ重组质粒构建 | 第33页 |
| 3.2.5 菌液 PCR 鉴定目的基因重组质粒 | 第33页 |
| 3.2.6 PLCζ重组质粒的酶切鉴定 | 第33页 |
| 3.2.7 目的基因的原核表达 | 第33-34页 |
| 3.2.8 目的蛋白的纯化 | 第34页 |
| 3.2.9 Western-Blot 分析 | 第34页 |
| 3.3 结果 | 第34-38页 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 | 第34-35页 |
| 3.3.2 重组表达质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| 3.3.3 原核产物的表达 | 第36-37页 |
| 3.3.4 融合蛋白的纯化和 WB 分析 | 第37-38页 |
| 3.4 讨论 | 第38-39页 |
| 3.5 小结 | 第39-40页 |
| 试验三 美利奴绵羊 PLCΖ重组质粒对卵母细胞激活的初步研究 | 第40-44页 |
| 摘要 | 第40页 |
| 4.1 材料 | 第40页 |
| 4.1.1 质粒、细胞 | 第40页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第40页 |
| 4.1.3 主要试剂配制 | 第40页 |
| 4.2 方法 | 第40-42页 |
| 4.2.1 重组质粒的制备 | 第40页 |
| 4.2.2 显微注射针及持卵针的制作 | 第40-41页 |
| 4.2.3 PBS 缓冲液（Phosphate Buffered Saline）和细胞培养液 DMEM 的制备 | 第41页 |
| 4.2.4 卵母细胞的准备 | 第41页 |
| 4.2.5 卵母细胞内质粒的注射 | 第41页 |
| 4.2.6 绵羊卵母细胞的孤雌激活及体外培养 | 第41-42页 |
| 4.3 结果 | 第42-43页 |
| 4.3.1 卵母细胞的体外培养 | 第42页 |
| 4.3.2 卵母细胞胞质内质粒的显微注射 | 第42-43页 |
| 4.4 讨论 | 第43页 |
| 4.5 小结 | 第43-44页 |
| 全文总结 | 第44页 |
| 创新点 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 作者简介 | 第53页 |
