| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略语表 | 第15-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-39页 |
| 1.1 古菌 | 第17-19页 |
| 1.1.1 古菌的概述 | 第17-18页 |
| 1.1.2 古菌的分类 | 第18-19页 |
| 1.1.3 硫化叶菌概述 | 第19页 |
| 1.2 DNA双链断裂的修复 | 第19-24页 |
| 1.2.1 非同源末端链接 | 第20-21页 |
| 1.2.2 同源重组修复 | 第21-23页 |
| 1.2.3 古菌中的同源重组修复 | 第23-24页 |
| 1.3 Holliday Junction解离酶 | 第24-32页 |
| 1.3.1 Holliday Junction | 第24-26页 |
| 1.3.2 HJ解离酶简介 | 第26-27页 |
| 1.3.3 细菌中的HJ解离酶 | 第27-29页 |
| 1.3.4 古菌中的HJ解离酶 | 第29-30页 |
| 1.3.5 真核生物的HJ解离酶 | 第30-32页 |
| 1.4 HJ链迁移蛋白 | 第32-33页 |
| 1.5 PIN结构域蛋白简介 | 第33-34页 |
| 1.6 AAA+蛋白简介 | 第34-36页 |
| 1.7 KH结构域简介 | 第36-37页 |
| 1.8 本论文的研究目的和内容 | 第37-39页 |
| 1.8.1 本论文的研究目的 | 第37-38页 |
| 1.8.2 本论文的研究内容 | 第38-39页 |
| 第二章 SisPINA的生物信息学和遗传学分析 | 第39-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第39-40页 |
| 2.1.2 培养基与其他材料 | 第40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-43页 |
| 2.2.1 敲除质粒pMID-SisPINA的构建 | 第40页 |
| 2.2.2 敲除质粒pMID-SisPINA的电转化 | 第40-41页 |
| 2.2.3 SisPINA整合型菌株的筛选与鉴定 | 第41页 |
| 2.2.4 SisPINA敲除菌株的筛选与鉴定 | 第41页 |
| 2.2.5 pSSRlacS-A-SisPINA遗传回补质粒的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.6 pSSRlacS-A SisPINA遗传回补菌株的构建 | 第42-43页 |
| 2.2.7 系统进化树的构建 | 第43页 |
| 2.3 实验结果 | 第43-51页 |
| 2.3.1 Hjc相互作用蛋白的鉴定 | 第43-44页 |
| 2.3.2 SisPINA的生物信息学分析 | 第44-47页 |
| 2.3.3 SisPINA编码基因的敲除 | 第47-49页 |
| 2.3.4 SisPINA的遗传回补分析 | 第49-51页 |
| 2.4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第三章 SisPINA的生化性质分析 | 第52-72页 |
| 3.1 实验材料 | 第52页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第52页 |
| 3.1.2 培养基 | 第52页 |
| 3.1.3 主要试剂和仪器 | 第52页 |
| 3.2 实验方法 | 第52-60页 |
| 3.2.1 SisPINA表达载体的构建 | 第52-53页 |
| 3.2.2 SisPINA定点突变体表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.3 SisHjc表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 3.2.4 SisPINA和SisHjc共表达载体的构建 | 第55页 |
| 3.2.5 SisPINA及其他蛋白在E.coli中的表达 | 第55-56页 |
| 3.2.6 SisPINA及其突变体蛋白的纯化 | 第56页 |
| 3.2.7 SisHjc(氨基端带6×组氨酸标签)的纯化 | 第56-57页 |
| 3.2.8 SisPINA(氨基端带6×组氨酸标签)和SisHjc(无标签)的共纯化 | 第57页 |
| 3.2.9 DNA底物的制备与纯化 | 第57-58页 |
| 3.2.10 ATPase活性检测 | 第58-59页 |
| 3.2.11 凝胶阻滞(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)实验 | 第59页 |
| 3.2.12 DNA解旋酶活性检测原理和方法 | 第59-60页 |
| 3.2.13 Western-blot | 第60页 |
| 3.2.14 Pull-down | 第60页 |
| 3.3 实验结果 | 第60-71页 |
| 3.3.1 SisPINA和SisHjc的纯化 | 第60-61页 |
| 3.3.2 SisPINA与SisHjc的相互作用 | 第61-63页 |
| 3.3.3 SisPINA的ATPase活性 | 第63-67页 |
| 3.3.4 SisPINA的DNA结合活性 | 第67-68页 |
| 3.3.5 SisPINA的解旋酶活性 | 第68-71页 |
| 3.4 本章小结 | 第71-72页 |
| 第四章 SisPINA与Hjc互作的功能分析及其与其他互作蛋白的鉴定 | 第72-91页 |
| 4.1 实验材料 | 第72页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第72页 |
| 4.1.2 培养基 | 第72页 |
| 4.1.3 主要试剂和仪器 | 第72页 |
| 4.2 实验方法 | 第72-76页 |
| 4.2.1 载体构建 | 第72-73页 |
| 4.2.2 Hjc,SisPINAΔC,Hjm和RFCs的表达和纯化 | 第73-74页 |
| 4.2.3 冰岛硫化叶菌SisPINA基因氨基端带6×组氨酸标签菌株的构建与蛋白纯化 | 第74-75页 |
| 4.2.4 潜在的与SisPINA相互作用的蛋白的鉴定 | 第75页 |
| 4.2.5 Pull-down实验 | 第75页 |
| 4.2.6 分子筛实验 | 第75页 |
| 4.2.7 Hjc核酸内切酶活性检测 | 第75-76页 |
| 4.3 实验结果 | 第76-89页 |
| 4.3.1 Hjc,SisPINAΔC,Hjm和RFC的纯化 | 第76页 |
| 4.3.2 SisPINA对SisHjc的HJ切割活性的影响 | 第76-78页 |
| 4.3.3 SisHjcE12A对SisPINA的HJ解旋活性的影响 | 第78-80页 |
| 4.3.4 氨基端6×组氨酸标签的SisPINA的纯化 | 第80-81页 |
| 4.3.5 潜在的与SisPINA相互作用蛋白的鉴定 | 第81-83页 |
| 4.3.6 SisPINA和RFCs具有物理相互作用 | 第83-84页 |
| 4.3.7 SisPINA和Hjm具有物理相互作用 | 第84-85页 |
| 4.3.8 SisPINA的羧基端是SisPINA与RFCs和Hjm相互作用的区域 | 第85-86页 |
| 4.3.9 RFCs抵制SisPINA的HJ解旋活性 | 第86-87页 |
| 4.3.10 SisPINA对Hjm解旋酶活性的影响 | 第87-89页 |
| 4.4 本章小结 | 第89-91页 |
| 第五章 SisPINA的晶体学研究 | 第91-110页 |
| 5.1 实验材料 | 第91页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第91页 |
| 5.1.2 培养基 | 第91页 |
| 5.1.3 主要试剂和仪器 | 第91页 |
| 5.2 实验方法 | 第91-94页 |
| 5.2.1 表达载体的构建 | 第91-92页 |
| 5.2.2 目的蛋白的表达 | 第92页 |
| 5.2.3 硒代甲硫氨酸蛋白的表达 | 第92页 |
| 5.2.4 目的蛋白的纯化 | 第92-93页 |
| 5.2.5 硒代甲硫氨酸蛋白的纯化 | 第93页 |
| 5.2.6 蛋白结晶条件的筛选 | 第93-94页 |
| 5.2.7 蛋白晶体的优化 | 第94页 |
| 5.2.8 晶体数据的处理 | 第94页 |
| 5.3 实验结果 | 第94-108页 |
| 5.3.1 重组蛋白的纯化 | 第94-95页 |
| 5.3.2 蛋白结晶条件 | 第95-97页 |
| 5.3.3 蛋白晶体的优化 | 第97页 |
| 5.3.4 蛋白晶体衍射数据的收集 | 第97-98页 |
| 5.3.5 蛋白晶体结构的解析 | 第98页 |
| 5.3.6 SisPINA-PIN的晶体结构 | 第98-99页 |
| 5.3.7 SisPINAK261A的晶体结构 | 第99-106页 |
| 5.3.8 SisPINAR206AR147KI199S的晶体结构 | 第106-108页 |
| 5.3.9 其他蛋白的晶体结构解析 | 第108页 |
| 5.4 本章小结 | 第108-110页 |
| 第六章 总结与讨论 | 第110-115页 |
| 附录 | 第115-122页 |
| 附录一 培养基 | 第115-116页 |
| 附录二 主要试剂和仪器 | 第116-117页 |
| 附录三 本论文所用的引物序列 | 第117-118页 |
| 附录四 PCR扩增及限制性内切酶双酶切体系 | 第118-119页 |
| 附录五 冰岛硫化叶菌S.islandicus E233S细胞的电转化方法 | 第119-120页 |
| 附录六 本论文制备DNA底物的寡核苷酸链 | 第120-121页 |
| 附录七 硒代甲硫氨酸蛋白的表达 | 第121-122页 |
| 参考文献 | 第122-130页 |
| 致谢 | 第130-133页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第133-134页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第134-135页 |
| 附件 | 第135-155页 |
