| 摘要 | 第12-14页 |
| ABSTRACT | 第14-15页 |
| 缩写符号 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-31页 |
| 1 糖链结构的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.1 糖链结构的种类 | 第17-19页 |
| 1.1.1 N-连接糖基化 | 第18-19页 |
| 1.1.2 O-连接糖基化 | 第19页 |
| 2 糖链的结构分析方法 | 第19-23页 |
| 2.1 糖链的释放 | 第19-21页 |
| 2.1.1 化学释放法 | 第19-20页 |
| 2.1.2 酶解释放法 | 第20-21页 |
| 2.2 糖链的荧光衍生 | 第21-22页 |
| 2.3 糖链的检测分析 | 第22-23页 |
| 2.3.1 毛细管电泳(CE)技术对糖链分析 | 第22页 |
| 2.3.2 核磁共振 | 第22-23页 |
| 2.3.3 液质联用在糖链分析中的应用 | 第23页 |
| 3 糖链的释放与N-糖酰胺酶 | 第23-26页 |
| 3.1 PNGase F样N-糖酰胺酶 | 第24-25页 |
| 3.2 PNGase A样N-糖酰胺酶 | 第25-26页 |
| 4 本研究的目的意义及内容 | 第26-27页 |
| 参考文献 | 第27-31页 |
| 第二章 PNGase H~+的基因克隆与重组表达纯化 | 第31-51页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 1.1 菌种 | 第31页 |
| 1.2 主要试剂与仪器 | 第31-32页 |
| 1.2.1 主要试剂 | 第31-32页 |
| 1.2.2 主要仪器设备 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.1 PNGase H~+的基因克隆 | 第32-38页 |
| 2.1.1 基因组DNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.1.2 PCR引物设计 | 第33页 |
| 2.1.3 PCR扩增 | 第33-34页 |
| 2.1.4 重组质粒构建 | 第34-35页 |
| 2.1.5 PCR检测 | 第35-36页 |
| 2.1.6 重组质粒的提取 | 第36页 |
| 2.1.7 酶切以及连接反应 | 第36-37页 |
| 2.1.8 挑斑检测 | 第37-38页 |
| 2.1.9 基因测序 | 第38页 |
| 2.2 重组PNGase H~+基因在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.1 重组质粒的提取 | 第38页 |
| 2.2.2 重组质粒转化至E.Coli BL21细胞 | 第38-39页 |
| 2.2.3 重组PNGase H~+基因在大肠杆菌中的表达 | 第39页 |
| 2.3 重组PNGase H~+基因表达产物的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第39-40页 |
| 2.3.1 溶液的配制 | 第39页 |
| 2.3.2 实验步骤 | 第39-40页 |
| 2.4 重组PNGase H~+基因表达产物的SDS-PAGE分析 | 第40-41页 |
| 2.4.1 溶液的配制 | 第40页 |
| 2.4.2 实验步骤 | 第40-41页 |
| 2.5 重组PNGase H~+酶活性初测 | 第41-43页 |
| 2.5.1 溶液的配置 | 第41页 |
| 2.5.2 反应体系 | 第41页 |
| 2.5.3 阳离子交换树脂结合糖肽 | 第41-42页 |
| 2.5.4 2-PA标记 | 第42页 |
| 2.5.5 G15柱除去多余2-PA | 第42页 |
| 2.5.6 色谱条件 | 第42页 |
| 2.5.7 MALDI-TOF质谱分析 | 第42-43页 |
| 3 结果分析 | 第43-49页 |
| 3.1 PNGase H~+基因的扩增结果 | 第43页 |
| 3.2 重组质粒双酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3.3 重组PNGase H~+基因转化后的PCR验证 | 第44-45页 |
| 3.4 重组PNGase H~+基因测序结果 | 第45页 |
| 3.5 重组PNGase H~+基因诱导表达产物的SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| 3.6 UPLC色谱分析结果 | 第46-47页 |
| 3.7 MALDI-TOF质谱分析结果 | 第47-49页 |
| 4 小结 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-51页 |
| 第三章 重组PNGase H~+酶活性测定方法的建立以及酶学特性测定 | 第51-61页 |
| 1 材料 | 第51-52页 |
| 1.1 主要仪器 | 第51页 |
| 1.2 主要试剂 | 第51-52页 |
| 2 实验步骤 | 第52-53页 |
| 2.1 重组PNGase H~+酶活性测定方法的建立 | 第52页 |
| 2.1.1 溶液的配置 | 第52页 |
| 2.1.2 反应体系 | 第52页 |
| 2.1.3 色谱条件 | 第52页 |
| 2.2 重组PNGase H~+酶学特性测定 | 第52-53页 |
| 2.2.1 pH对重组PNGase H~+酶的影响 | 第52-53页 |
| 2.2.2 温度对重组PNGase H~+酶的影响 | 第53页 |
| 2.2.3 金属离子对重组PNGase H~+酶的影响 | 第53页 |
| 2.2.4 表面活性剂对重组PNGase H~+酶的影响 | 第53页 |
| 3 结果分析 | 第53-59页 |
| 3.1 重组PNGase H~+酶活性测定方法的建立 | 第53-54页 |
| 3.2 重组PNGase H~+酶学特性测定 | 第54-59页 |
| 3.2.1 pH值对重组PNGase H~+酶的影响 | 第54-56页 |
| 3.2.2 温度对重组PNGase H~+酶的影响 | 第56-57页 |
| 3.2.3 金属离子对重组PNGase H~+酶的影响 | 第57-58页 |
| 3.2.4 表面活性剂对重组PNGase H~+酶的影响 | 第58-59页 |
| 4 小结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-61页 |
| 第四章 重组PNGase H~+酶对不同底物的特异性 | 第61-71页 |
| 1 材料 | 第61-62页 |
| 1.1 主要仪器 | 第61页 |
| 1.2 主要试剂 | 第61-62页 |
| 2 实验步骤 | 第62-64页 |
| 2.1 SDS-PAGE检测重组PNGase H~+酶对底物的去糖基化作用 | 第62页 |
| 2.2 UPLC检测重组PNGase H~+酶对底物的去糖基化作用 | 第62-64页 |
| 2.2.1 重组PNGase H~+酶对糖蛋白的作用 | 第62-63页 |
| 2.2.2 重组PNGase H~+对糖肽的作用 | 第63页 |
| 2.2.3 N-糖链的纯化 | 第63页 |
| 2.2.4 2-AB标记[1-3] | 第63页 |
| 2.2.5 色谱分析 | 第63-64页 |
| 2.3 MALDI-TOF质谱分析 | 第64页 |
| 2.3.1 溶液的配制 | 第64页 |
| 2.3.2 MALDI-TOF质谱条件 | 第64页 |
| 3 结果分析 | 第64-67页 |
| 3.1 SDS-PAGE检测重组PNGase H~+酶对不同底物的去糖基化作用 | 第64-65页 |
| 3.2 UPLC检测重组PNGase H~+酶对不同底物的去糖基化作用 | 第65-67页 |
| 4 小结 | 第67-70页 |
| 参考文献 | 第70-71页 |
| 全文结论 | 第71-73页 |
| 论文创新点 | 第73-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 攻读硕士学位发表论文情况 | 第77页 |
