| 中英文縮略语对照表 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-36页 |
| 1 大片段基因组文库的研究进展 | 第17-20页 |
| ·噬菌体文库 | 第17页 |
| ·Cosmid文库 | 第17-18页 |
| ·Fosmid文库 | 第18-19页 |
| ·BAC文库 | 第19页 |
| ·YAC文库 | 第19页 |
| ·大片段基因组文库的应用 | 第19-20页 |
| 2 反向遗传学技术研究概述 | 第20-27页 |
| ·同源重组 | 第20-21页 |
| ·RNAi | 第21页 |
| ·Morpholinos | 第21页 |
| ·TILLING | 第21-22页 |
| ·ZFN | 第22-23页 |
| ·TALEN | 第23-25页 |
| ·CRISPR/Cas9 | 第25-26页 |
| ·反向遗传学技术在性别决定与分化研究中的应用 | 第26-27页 |
| 3 脊椎动物性别决定与分化研究进展 | 第27-33页 |
| 4 科学问题的提出和本研究目的意义 | 第33-36页 |
| 第二章 罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库的构建及基因筛选 | 第36-46页 |
| 1 引言 | 第36-37页 |
| 2 材料与方法 | 第37-40页 |
| ·实验材料 | 第37页 |
| ·主要试剂 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-40页 |
| ·尼罗罗非鱼XY个体基因组DNA的提取 | 第37页 |
| ·基因组DNA片段的末端修复 | 第37-38页 |
| ·连接、包装和滴度计算 | 第38页 |
| ·插入片段大小检测 | 第38页 |
| ·文库的稳定性检测 | 第38页 |
| ·克隆的挑取、池的构建及备份保存 | 第38-39页 |
| ·基因筛选方法 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-44页 |
| ·抽提的DNA片段大小 | 第40页 |
| ·DNA片段回收与载体的连接 | 第40-41页 |
| ·文库滴度 | 第41页 |
| ·插入片段大小 | 第41页 |
| ·文库稳定性 | 第41-42页 |
| ·文库克隆的保存和池的构建及备份 | 第42页 |
| ·文库的应用—目的基因筛选结果 | 第42-44页 |
| 4 讨论 | 第44-46页 |
| ·Fosmid文库质量鉴定、保存及基因筛选策略 | 第44-45页 |
| ·Fosmid文库在性别决定和分化研究中的应用 | 第45-46页 |
| 第三章 利用TALEN基因敲除技术研究Foxl2和Dmrt1功能 | 第46-68页 |
| 1 引言 | 第46-47页 |
| 2 材料和方法 | 第47-53页 |
| ·实验动物 | 第47-48页 |
| ·主要试剂和TALEN载体 | 第48页 |
| ·方法 | 第48-53页 |
| ·TALEN打靶序列的选择和载体构建策略 | 第48-49页 |
| ·mRNA合成与显微注射 | 第49-50页 |
| ·基因组DNA的提取、目的片段的扩增及酶切检测 | 第50页 |
| ·阳性鱼筛选 | 第50页 |
| ·组织学检测 | 第50-51页 |
| ·免疫组化检测 | 第51页 |
| ·Real-time PCR检测 | 第51页 |
| ·RT-PCR检测 | 第51-52页 |
| ·血清雌雄激素水平测定 | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-64页 |
| ·TALEN成功敲除dmrt1和foxl2基因 | 第53-58页 |
| ·Dmrt1缺失对XY个体罗非鱼性腺分化的影响 | 第58-59页 |
| ·Foxl2缺失对XX个体罗非鱼性腺分化的影响 | 第59-63页 |
| ·Dmrt1和Foxl2缺失对雌激素和雄激素合成的影响 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-68页 |
| ·养殖鱼类罗非鱼TALEN靶向基因敲除技术的建立 | 第64-65页 |
| ·Dmrt1缺失对精巢分化的影响 | 第65页 |
| ·Foxl2缺失对卵巢发育的影响 | 第65-66页 |
| ·Dmrt1和Foxl2拮抗性调控雌激素水平影响性别分化 | 第66-68页 |
| 第四章 利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Nanos2和Nanos3的功能 | 第68-86页 |
| 1 引言 | 第68-69页 |
| 2 材料和方法 | 第69-73页 |
| ·实验动物 | 第69页 |
| ·主要试剂和载体 | 第69页 |
| ·方法 | 第69-73页 |
| ·靶序列的选择和gRNA合成 | 第69-70页 |
| ·Cas9 mRNA合成与显微注射 | 第70-71页 |
| ·基因组DNA的提取、目的片段扩增及突变检测 | 第71页 |
| ·GFP-vasa 3'UTR载体构建和生殖细胞GFP标记 | 第71-72页 |
| ·敲除阳性鱼的筛选 | 第72页 |
| ·组织学检测 | 第72页 |
| ·免疫组化检测 | 第72页 |
| ·激素测定 | 第72页 |
| ·dmrt1和foxl2突变F1代的建立 | 第72-73页 |
| 3 结果 | 第73-80页 |
| ·CRISPR/Cas9成功敲除罗非鱼基因 | 第73-75页 |
| ·敲除效率统计 | 第75-76页 |
| ·Nanos缺失对生殖细胞和性别分化的影响 | 第76-78页 |
| ·生殖细胞缺失对雌激素和雄激素合成的影响 | 第78页 |
| ·dmrt1和foxl2突变F1代鱼检测 | 第78-80页 |
| 4 讨论 | 第80-83页 |
| ·CRISPR/Cas9高效敲除罗非鱼性别决定与分化关键基因 | 第80页 |
| ·CRISPR/Cas9介导突变的可遗传性 | 第80-81页 |
| ·生殖细胞缺失对性别分化的影响 | 第81-82页 |
| ·CRISPR/Cas9在性别决定与分化研究的应用前景 | 第82-83页 |
| 附件 | 第83-86页 |
| 第五章 利用CRISPR/Cas9研究Igf3在性别分化中的功能 | 第86-108页 |
| 1 引言 | 第86-88页 |
| 2 材料和方法 | 第88-92页 |
| ·实验动物 | 第88页 |
| ·试剂和药品 | 第88页 |
| ·igf3在性别分化早期表达模式检测 | 第88页 |
| ·免疫组化检测Igf3表达的细胞类型 | 第88-89页 |
| ·Igf3功能的离体研究 | 第89-90页 |
| ·CRISPR/Cas9敲除igf3对性别分化的影响 | 第90-91页 |
| ·荧光素酶报告基因和表达载体的构建 | 第91页 |
| ·HEK283细胞培养、瞬时转染以及荧光素酶检测 | 第91-92页 |
| ·Dmrt1和Foxl2缺失对igf3表达水平的影响 | 第92页 |
| 3 结果 | 第92-102页 |
| ·igf3在罗非鱼性腺发育早期的表达模式 | 第92-93页 |
| ·Igf3表达于罗非鱼性腺体细胞 | 第93页 |
| ·Igf3调控性别分化相关类固醇酶和转录因子 | 第93-95页 |
| ·CRISPR/Cas9介导的够敲除 | 第95-96页 |
| ·igf3敲除对性别分化和相关基因表达的影响 | 第96-100页 |
| ·igf3表达受性别分化相关转录因子和雌激素的调控 | 第100-102页 |
| 4 讨论 | 第102-108页 |
| ·igf3、转录因子和类固醇酶之间的关系 | 第102-105页 |
| ·Igf3与硬骨鱼类生殖细胞减数分裂 | 第105-108页 |
| 结论 | 第108-110页 |
| 本研究的主要创新点 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-130页 |
| 致谢 | 第130-132页 |
| 在读期间发表的主要论文 | 第132-134页 |
| 在读期间参加科研情况 | 第134页 |
