| 目录 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-43页 |
| ·生物体中的钙离子 | 第17-27页 |
| ·钙离子信号传导的基本原理 | 第17-20页 |
| ·钙离子与自交不亲和性 | 第20页 |
| ·花粉萌发和花粉管生长中的钙 | 第20-22页 |
| ·Ca~(2+)传感器类型 | 第22-24页 |
| ·EF-hand结构域 | 第24-27页 |
| ·蛋白相互作用的主要研究方法 | 第27-32页 |
| ·GST p μL1-down技术 | 第28页 |
| ·酵母双杂交系统 | 第28-30页 |
| ·相互作用研究的其他方法 | 第30-32页 |
| ·植物花粉特异性基因研究进展 | 第32-35页 |
| ·TA29基因 | 第34页 |
| ·Bp4基因 | 第34页 |
| ·LAT52基因 | 第34-35页 |
| ·基因功能研究的策略 | 第35-39页 |
| ·反义基因技术 | 第35-36页 |
| ·RNA干涉技术 | 第36页 |
| ·病毒诱导基因沉默 | 第36-37页 |
| ·目的基因超量表达或异位表达 | 第37页 |
| ·基因敲除 | 第37-39页 |
| ·研究目的与意义 | 第39-41页 |
| ·技术路线 | 第41-43页 |
| 第二章 甘蓝钙感应蛋白CML49基因的克隆与序列分析 | 第43-61页 |
| ·材料 | 第43页 |
| ·植物材料 | 第43页 |
| ·实验试剂 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-49页 |
| ·实验试剂的配制 | 第43-44页 |
| ·花粉萌发实验及总蛋白双向电泳 | 第44页 |
| ·甘蓝基因组DNA提取 | 第44-45页 |
| ·甘蓝花粉总RNA的提取 | 第45页 |
| ·cDNA的合成 | 第45-46页 |
| ·引物设计 | 第46-47页 |
| ·CML49基因的克隆与序列分析 | 第47-49页 |
| ·结果与分析 | 第49-59页 |
| ·双向电泳鉴定钙感应蛋白 | 第49-50页 |
| ·甘蓝花粉总RNA及gDNA的质量检测 | 第50页 |
| ·CML49的gDNA克隆 | 第50-51页 |
| ·甘蓝花粉CML49的cDNA克隆 | 第51-52页 |
| ·甘蓝花粉CML49的序列分析 | 第52-57页 |
| ·CML49基因原核表达分析 | 第57页 |
| ·CML49在植株不同部位的表达分析 | 第57-58页 |
| ·CML49在花粉萌发中的表达量分析 | 第58-59页 |
| ·讨论 | 第59-60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 第三章 甘蓝类钙调蛋白CML49与SRK相互作用检测 | 第61-77页 |
| ·材料 | 第61-63页 |
| ·植物材料 | 第61页 |
| ·质粒与菌株 | 第61页 |
| ·工具酶和主要分子生物学试剂盒 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61-62页 |
| ·实验试剂的配制 | 第62-63页 |
| ·试验方法 | 第63-66页 |
| ·CML49与SRK7基因扩增的引物设计 | 第63页 |
| ·甘蓝自交不亲和系E1的SRK7基因的克隆 | 第63-64页 |
| ·CML49与SRK7体外相互作用检测 | 第64页 |
| ·CML49与SRK7酵母重组表达载体的构建 | 第64页 |
| ·酵母感受态制备和转化 | 第64-65页 |
| ·重组质粒毒性检测和自激活检测 | 第65-66页 |
| ·二倍体酵母的融合及其蛋白互作检测 | 第66页 |
| ·结果与分析 | 第66-74页 |
| ·SRK基因片段的克隆 | 第66页 |
| ·SRK序列分析 | 第66-70页 |
| ·CML49与SRK7原核表达载体构建及体外相互作用检测 | 第70页 |
| ·CML49与SRK7信号肽分析 | 第70-71页 |
| ·CML49及SRK7酵母表达载体的构建 | 第71页 |
| ·毒性检测与白激活鉴定 | 第71-72页 |
| ·CML49与SRK7蛋白相互作用鉴定 | 第72-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| ·小结 | 第75-77页 |
| 第四章 甘蓝花粉管CML49与SRK7相互作用区域筛选 | 第77-93页 |
| ·材料 | 第77页 |
| ·菌株及载体质粒 | 第77页 |
| ·实验试剂 | 第77页 |
| ·主要仪器 | 第77页 |
| ·方法 | 第77-80页 |
| ·SRK7截短体及CML49突变体扩增引物设计 | 第77-78页 |
| ·甘蓝花粉钙调蛋白基因CML49突变体的构建 | 第78页 |
| ·原核表达载体构建及体外检测 | 第78-79页 |
| ·SRK7截短体与CML49扩增及酵母表达载体构建 | 第79页 |
| ·酵母感受态制备和转化 | 第79页 |
| ·重组质粒自激活和毒性检测 | 第79页 |
| ·二倍体酵母的融合及其蛋白互作检测 | 第79-80页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性测定 | 第80页 |
| ·结果与分析 | 第80-91页 |
| ·eSRK7和iSRK7基因片段的亚克隆 | 第80页 |
| ·甘蓝CML49突变体的构建 | 第80-81页 |
| ·CML49与iSRK7、eSRK7原核表达载体构建 | 第81页 |
| ·CML49突变体原核表达载体构建 | 第81-82页 |
| ·甘蓝CML49与SRK7原核表达产物相互作用区域筛选 | 第82-84页 |
| ·CML49突变体酵母表达载体构建 | 第84-85页 |
| ·SRK7及其亚域毒性检测与自激活鉴定 | 第85-86页 |
| ·CML49与iSRK7、eSRK7亚域相互作用分析 | 第86-88页 |
| ·CML49与SRK7、iSRK7、eSRK7酵母相互作用强度分析 | 第88-89页 |
| ·CML49及其突变体酵母表达载体毒性和白激活检测 | 第89页 |
| ·CML49突变体与SRK7、iSRK7、eSRK7酵母相互作用分析 | 第89-91页 |
| ·讨论 | 第91-92页 |
| ·小结 | 第92-93页 |
| 第五章 番茄花粉特异性启动子LAT52的克隆及功能验证 | 第93-103页 |
| ·材料 | 第93页 |
| ·植物材料 | 第93页 |
| ·质粒与菌株 | 第93页 |
| ·实验试剂 | 第93页 |
| ·主要仪器 | 第93页 |
| ·方法 | 第93-97页 |
| ·番茄DNA的提取 | 第93页 |
| ·引物设计 | 第93-94页 |
| ·番茄LAT52启动子的克隆 | 第94页 |
| ·番茄LAT52启动子与GUS融合表达载体构建 | 第94页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第94-95页 |
| ·农杆菌蘸花法侵染花序 | 第95-96页 |
| ·再生体系培养基 | 第96页 |
| ·表达载体对甘蓝的遗传转化 | 第96-97页 |
| ·GUS组织化学染色检测 | 第97页 |
| ·结果与分析 | 第97-101页 |
| ·番茄gDNA的提取 | 第97-98页 |
| ·番茄LAT52启动子的克隆 | 第98-99页 |
| ·番茄LAT52启动子序列分析 | 第99页 |
| ·番茄LAT52表达载体构建 | 第99-100页 |
| ·番茄LAT52启动子在拟南芥中验证 | 第100页 |
| ·番茄LAT52启动子在甘蓝中的功能验证 | 第100-101页 |
| ·讨论 | 第101-102页 |
| ·小结 | 第102-103页 |
| 第六章 甘蓝CML49反义表达载体构建对甘蓝反义转化 | 第103-109页 |
| ·材料与方法 | 第103-105页 |
| ·材料 | 第103页 |
| ·再生体系培养基 | 第103页 |
| ·CML49反义基因片段的扩增与克隆 | 第103-104页 |
| ·CaMV35S及LAT52启动的反义表达载体构建 | 第104页 |
| ·反义表达载体转化农杆菌 | 第104-105页 |
| ·农杆菌介导法转化甘蓝 | 第105页 |
| ·结果与分析 | 第105-108页 |
| ·CML49反义基因片段的克隆 | 第105页 |
| ·CML49反义表达载体的构建 | 第105-106页 |
| ·反义表达载体农杆菌中质粒鉴定 | 第106页 |
| ·CML49反义载体转化甘蓝植株的获得 | 第106-108页 |
| ·讨论 | 第108页 |
| ·小结 | 第108-109页 |
| 第七章 CML49反义转基因植株分子检测及其功能分析 | 第109-123页 |
| ·材料 | 第109页 |
| ·方法 | 第109-114页 |
| ·植物总DNA、RNA的提取 | 第109页 |
| ·转化植株的PCR检测 | 第109-110页 |
| ·转基因植株的Southern blot分析 | 第110-113页 |
| ·反义CML49转基因植株花粉的原位萌发检测 | 第113-114页 |
| ·结果与分析 | 第114-119页 |
| ·反义转基因植株DNA的提取 | 第114页 |
| ·反义转基因植株gDNA PCR检测 | 第114-115页 |
| ·CML49反义转基因植株Southern blot杂交检测 | 第115-116页 |
| ·反义CML49转基因植株的表形观察 | 第116页 |
| ·CML49转基因植株花粉的原位萌发检测 | 第116-117页 |
| ·反义CML49转基因植株花粉的体外萌发检测 | 第117-118页 |
| ·反义CML49转基因植株花粉的定量表达分析 | 第118-119页 |
| ·讨论 | 第119-120页 |
| ·反义CML49转基因植株的检测 | 第119页 |
| ·类钙调蛋白编码基因CML49的功能分析 | 第119-120页 |
| ·小结 | 第120-123页 |
| 第八章 结论及创新点 | 第123-125页 |
| ·结论 | 第123页 |
| ·创新点 | 第123-124页 |
| ·下一步研究计划 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-141页 |
| 附录 | 第141-143页 |
| 致谢 | 第143-145页 |
| 项目资助 | 第145-147页 |
| 在学期间发表论文 | 第147-148页 |
| 在学期间参与的科研项目 | 第148页 |
